铁调素对人成骨细胞增殖、凋亡、钙化功能的影响

陈丕绩

(深圳市盐田区人民医院检验科，广东 深圳 518081)

骨质疏松(Osteoporosis)主要指由于多种原因引发的、以单位体积内骨组织量减少为主要特点的代谢性骨类疾病[1]，随着社会老龄化的加剧，骨质疏松的发病率越来越高，其发病缓慢，以骨骼疼痛或易于骨折为主要特征，尤以老年人发病率居高。骨质疏松进展无明显体征，不易被患者发现，短期内无法治愈，是引发一系列骨科疾病的主要病因之一，严重影响患者健康和生活质量。成骨细胞目前是骨质疏松相关研究的主要组织平台，由于骨质疏松从病理学改变方面研究，是成骨细胞中的Ⅰ型胶原分泌量明显减少，使钙结节形成受限，进而产生骨质的变化[2]。研究表明，铁过量或铁分布错位是造成骨质疏松的一个重要因素[3]，铁调素具有铁过量的下调作用，因而对成骨细胞的生物活性可能存在一定的影响作用。本文通过对人成骨细胞株的培养实验，探讨铁调素在人成骨细胞增殖、凋亡、钙化方面的作用和影响。

1 资料与方法

1.1 成骨细胞制备 人成骨细胞(hFOB1.10)由中国科学院上海细胞所细胞库提供，置于5%CO2和34℃环境下培养，培养基采用DMEM(高糖)：F12=1:1+10%胎牛血清+0.3‰G418(Amersco公司提供)，培养3～4 d，检测细胞密度达90%后，使用胰蛋白酶消化，再分种于12孔的培养板上，培养板上每孔置入一块无水乙醇处理过的圆形盖玻片。

1.2 设备及试剂 铁调素由日本Peptide机构生产，MTT溶液由(0.5 g MTT+100 ml磷酸缓冲液(PBS)+0.22μm滤膜过滤)自行配置，二甲基亚砜(DMSO)由上海青鸿化工有限公司提供，碧云天由BestBuo贝博生物公司提供，蔡司荧光显微镜由Carl Zaiss公司生产，流式细胞仪由Beckman Coulter公司生产。

1.3 分组及检测方法

1.3.1 增殖活性 铁调素对成骨细胞增殖活性的影响采用MTT法检测。取置备好的血清培养液，配置hFOB1.10细胞为浓度2×104个/m细胞悬液，取96孔培养板接种，每孔100μl，于34℃、饱和湿度、15%CO2环境下培养至形成单层细胞，吸弃培养液后，取18孔分为三组，100 nmol/L组、200 nmol/L组和对照组，各6孔。100 nmol/L组加入100 nmol/L铁调素，200 nmol/L组加入200 nmol/L铁调素，对照组不加入铁调素。各组均间隔24 h换液，并于培养48 h后用PBS洗涤，再分别加入无血清培养液200μl及MTT溶液200μl，4 h后吸弃培养液，再于各孔加入DMSO，采用酶联免疫检测仪进行吸光度OD490检测，比较铁调素对成骨细胞增殖的作用。

1.3.2 凋亡检测 取置备好的血清培养液，配置hFOB1.10细胞为浓度2×105个/m细胞悬液，于6孔板接种每孔2 ml，24 h后弃培养基，分100 nmol/L组、200 nmol/L组和对照组三组，100 nmol/L组加入100 nmol/L铁调素、200 nmol/L组加入200 nmol/L铁调素，对照组不加铁调素。34℃、饱和湿度、5%CO2环境下间隔24 h换液，48 h后用胰酶消化，PBS洗涤，碧云天混合于室温孵育10 min，离心吸弃上清液，冰浴避光10 min，流式细胞仪检测成骨细胞凋亡率。

1.3.3 钙化功能 采用钙结节染色法，12孔培养板上分种1×105个/孔细胞，间隔24 h行培养基更换，同样分三组，对照组加入100μl双蒸水，100 nmol/L组加入100 nmol/L铁调素、200nmol/L组加入200nmol/L铁调素。间隔24 h更换培养基，15 d弃培养基，以4%多聚甲醛行30 min固定，后PBS洗涤2～3次，加入5%硝酸银，置于阳光下暴晒30 min，再次PBS洗涤，加入5%硫代硫酸钠静置2 min，PBS再次漂洗2～3次，1%中性红复染，10 min后PBS洗涤两次，于光学显微镜下对各组钙结节形成情况进行观察。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计学处理软件包进行数据分析，计量资料采用均值±标准差(±s)表示，F检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 成骨细胞增殖活性 MTT法检测结果详见表1，三组成骨细胞增殖活性接近，经统计学比较差异无统计学意义(F=2.38，P＞0.05)。

2.2 成骨细胞凋亡检测 随着铁调素剂量的减少，成骨细胞凋亡率逐渐增高，数据经统计学比较差异具有统计学意义(F=12.28，P＜0.05)，见表1。

2.3 成骨细胞钙结节形成 利用铁调素分组实验15 d后，染色的三组经观察可见细胞外基质矿化钙结节形成，利用光学显微镜观察，钙化灶呈黑色，散点状分布且不均匀。采用显微镜标尺和培养板密度共同测量成骨细胞钙结节数量，结果见表1，随着铁调素干预的减少，钙结节计数呈下降趋势，三组成骨细胞钙结节计数经统计学比较差异具有统计学意义(F=18.28，P＜0.01)。

表1 三组细胞增殖活性、凋亡检测及钙结节计数比较（±s）

表1 三组细胞增殖活性、凋亡检测及钙结节计数比较（±s）

组别200 nmol/L组100 nmol/L组对照组成骨细胞增殖活性(nmonl/L)0.74±0.140.72±0.230.73±0.09成骨细胞凋亡率(%)2.38±0.334.96±0.417.32±0.32成骨细胞钙结节计数(个)287±15145±945±6

3 讨论

铁调素又被称为“肝脏抗菌多肽”，21世纪初才经由两个独立实验室分别从人类血清及尿液中提取而成[3]。研究表明铁调素对于人体内铁元素状态的调节以及肠道内铁吸收的活性有着十分关键的作用[4]。铁元素广泛的参与到人体肌红蛋白、血红蛋白的合成当中，是细胞色素氧化酶的组成成分，对线粒体电子传递有参与作用，为三羧酸循环中的酶及其他因子提供有效的铁环境，对人体的代谢及呼吸功能有很大的影响效应[5]。近些年来，随着骨科病理研究的不断深入，发现成骨细胞内Ⅰ型胶原的分泌减少和钙结节的形成减少是骨质疏松的主要成因，在骨重建系统中，成骨细胞的激活对于铁元素具有很强的敏感性，但巨噬细胞分化形成的破骨细胞，却能够在大量的铁沉积环境下正常生长，促使铁过量或铁分布错位成为骨质疏松的一个重要诱发因素[6]。因而，铁调素对铁过量或铁分布错位的有效调节可能为成骨细胞的生长提供良好的体内环境，对骨质疏松有较好的病理学改善作用。

张鹏等[7]针对铁动态平衡改变对骨代谢的影响做了实验性研究，结果表明不同铁调素的干预可引起钙离子不同荧光强度的反应，随着hFOB1.10外铁调素浓度的增加，钙离子更大量的向细胞内转运，而hFOB1.10外铁离子浓度的下降能够促进钙离子转运至细胞内，说明通过铁调素降低铁离子的含量，可促进成骨细胞对钙的吸收。刘树欣等[8]的报道则对细胞铁代谢相关性的研究进展进行了概述与总结，文章指出，铁调素已被证实对于十二指肠的铁吸收、控制组织细胞内的铁稳定和促进巨噬细胞内的铁释放有较好作用。赵东阳等[9]的研究提示铁调素的干预对细胞内铁离子含量有明显影响，且其影响在0～100 nmol/L的范围内有明显的剂量依赖性。

本研究主要从骨科角度对铁调素与成骨细胞相关性进行了实验研究，并细致的将成骨细胞化分为增殖、凋亡、钙化三个阶段，结果表明，铁调素的干预对于成骨的增殖无显著影响，但对其凋亡和钙化作用明显。随着铁调素用量的增加，成骨细胞凋亡率明显降低，而钙化计数明显增高，提示铁调素对于促进骨质内部的钙吸收、减少骨细胞损伤和凋亡具有重要的促进作用。骨质疏松已经成为严重危害老年人健康与生活质量的常见疾病[10]，由于其发展缓慢，不易迅速表现为明显的体征而被患者关注。临床对骨质疏松的治疗应从病理学角度增强患者的骨能量，促进骨钙的吸收，使骨密度逐渐提升并获得较好的细胞营养作用。钙化能力的增强及凋亡的减少，是成骨细胞生长和改善患者骨质状况的必要条件，从而减轻老年骨质疏松患者的痛苦，提高生活质量，延长寿命。总之，铁调素对于成骨细胞有着较好的促生长作用，能够有效调节人体内铁元素环境，对于进一步研究骨质疏松的防治具有重要参考价值。

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[9]赵东阳,徐又佳,张 鹏,等.铁调素对成骨细胞内铁离子转运的影响[J].中国骨质疏松杂志,2008,14(9):611-614.

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