全自动毛细管电泳仪在血红蛋白分析中的应用

阮丽明，周艳洁，丁进龙，梁立阳，何桂琼，梁 萧，苏国生

（1.南宁市人口和计划生育服务中心，广西 南宁 5300222.南宁市第四人民医院，广西 南宁 530023）

血红蛋白病可分为异常血红蛋白病和地中海贫血（地贫），地中海贫血是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一[1-2]，广西是地贫的高发区[3]。根据地贫病变发生的珠蛋白链不同可分为α地贫和β地贫。分离量化和鉴定患者的血红蛋白成分对于地贫各种类型的临床诊断及治疗具有重大意义。毛细管血红蛋白电泳能够定量检测血红蛋白A(HbA)、血红蛋白F-(HbF)、血红蛋白A2(HbA2)含量以及其他异常血红蛋白，可用于诊断地中海贫血及其他血红蛋白病[4]。为了解全自动毛细管电泳仪在血红蛋白分析中的临床应用价值，本研究针对5088例项目人群进行电泳分析，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009年1～9月，对分布在南宁市6城区及所辖6县（共96个乡镇）的5457对（10914人）年龄20～40岁（广西籍10907人、广东籍5人、四川籍2人）的农村新婚夫妇进行地贫筛查。对筛查人群中血常规一方或双方异常[红细胞平均体积（MCV）＜80 fl]的5088例进行毛细管电泳分析，并选出229例做地贫基因分析。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集及处理 用一次性真空采血管（含EDTAK2抗凝剂）采集上述人群静脉血2～3 ml，摇匀抗凝。

1.2.2 毛细管区带电泳 采用法国Sebia公司生产的Cap2illarys 2全自动毛细管电泳仪（The Capillary Sebia，Parc Leonard de Vinci，CP 8010 Lisses，91008 EVRY，France）（法国Sebia公司6.11软件版本Capillarys@）及其配套血红蛋白电泳试剂盒CAPILLARYSHEMOGLOB IN（E）。（CAT No.19096、09107、12037）。按照仪器操作说明书进行，抗凝标本直接离心取沉淀红细胞加入试管中（标本量＞200μl）。把装有标本的试管按顺序放在仪器配套的检测架上（一个检测架一次一批可检测7个标本，可同时检测多批标本），在检测架第八管位置加入大约4 ml的溶血试剂。把检测架送入Cap illarys 2全自动毛细管电泳仪进行血红蛋白电泳检测，约30 min后全部检测程序完毕，查看结果。

1.2.3 质控品准备 取SEB IA公司提供的正常HbA2质 控 品[（SEBIA，PN 4778）CAT No.25055、21105）]。用1 ml蒸馏水或去离子水溶解，把溶解的质控品加入一个微型试管中。除去微型试管管帽。把此微型试管放入一个作为底座的新溶血试管，放置于样品架No.0的1号位置，按上述标本步骤测定。

1.2.4 基因检测 3种常见缺失型α地贫基因分析采用Gap-PCR技术，3种非缺失型α地贫基因和17种β地贫基因分析采用反向斑点杂交技术（RDB），用深圳益生堂生物企业有限公司生产的全血基因组提取试剂盒和基因诊断试剂盒进行检测。

1.3 统计学方法 对实验数据分布范围的统计，使用SPSS 14.0统计学软件。

2 结果

2.1 血红蛋白电泳的检测结果 10914人中对MCV＜80 fl的5088例标本进行电泳，发现异常1042例，其中β地贫757例（HbA2＞4.0%），HbF增高23例，HbCS262例，见表1。

表1 毛细管电泳异常结果

5088例标本中选出229例同时进行毛细管电泳和地贫基因检测，以基因为金标准，比较毛细管电泳筛查α和β地中海贫血中常见异常区带的符合率。229例标本基因检测结果：正常有50例，β地中海贫血74例，异常血红蛋白E(HbE)7例、血红蛋白H(HbH)病46例、异常血红蛋白(HbCS)40例。以上病例的毛细管电泳分析显示每个血红蛋白显示的锋都出现在特定的区域：HbCS=Z2、HbA2=Z3、HbE=Z4、HbF=Z7、HbA=Z9、HbH=Z15、血红蛋白 Bart's(Hb-Bart's)=Z12。

2.2 毛细管电泳对β地中海贫血及异常HbE的筛查β地贫患者毛细管电泳HbA2（Z3）74例都出现增高，其中59例伴有HbF增高（见表2）。7例HbE存在时，同样可对HbA2定量（见图1）。

2.3 毛细管电泳对α地中海贫血中异常区带的筛查 46例HbH病电泳中出现HbH区带（Z15）23例，HbH+HbBart's区带18例，合并有HbCS区带（Z2）4例（见图2）；有1例HbH病在电泳检测中漏诊，与基因结果符合率为97.83%，这1例的基因型为-SEA/-α 3.7。Hb Constant Spring（HbCS）杂合子40例中有2例未检出，与基因符合率为95.00%（见表3）。

表2 毛细管电泳对β地中海贫血及HbE杂合子测定结果（±s，%）

表2 毛细管电泳对β地中海贫血及HbE杂合子测定结果（±s，%）

类型 例数HbF HbA 2 HbE 与基因符合率β地贫HbE杂合子747 1.2±1.0（59例）5.3±1.14.0±0.4724.3±3.2100100

表3 HbH病及HbCS杂合子电泳结果分析（±s,%）

表3 HbH病及HbCS杂合子电泳结果分析（±s,%）

类型HbH病HbCS杂合子例数4538 HbH 4.3±3.3(23例）-HbBart's 1.4±1.0（18例）-HbA 2 1.0±0.22.2±0.2 HbCS 3.5±0.4（4例）0.77±0.78与基因符合率97.8395.00

图1 HbE杂合子（βE）HbF：0.9%，HbE26.5%，HbA2：3.8%

图2 HbH病（--SEA/aaCS）HbH：6.3%，HbBart`s：1.5%HbCS：3.2%

3 讨论

全自动毛细管电泳法是在充满电泳液的石英毛细管中进行电泳的技术，在溶血试剂中进行稀释的红细胞样品，会被注射到毛细管的负极端，在高压电的作用下竞相电泳分离，然后Hb会被靠近正极端的415 nm光波检测装置检测到[5]。通过毛细管电泳将蛋白质分离，采用波长为200 nm氘光源和CCD探测器，对血红蛋白成分分析灵敏度和分辨率高[6]。我们对法国Sebia公司Cap illarys 2全自动毛细血管电泳系统进行了评价，证明该系统具有较高的精密度及准确度。直接检测可准确地对各种血红蛋白组份相对定量，尤其是那些重要的组份，例如HbA、HbA2、HbE、HbF、HbH、HbBart's、HbCS。在α地贫中，成人用毛细管血红蛋白电泳方法检出的异常区带有HbH、HbBart's和HbCS，HbH病和HbCS与基因分析的符合率为97.83%和95.00%，漏诊的主要原因可能与不稳定血红蛋白的降解有关。β地贫主要表现为HbA2、HbF增高，毛细管电泳与基因基因诊断结果吻合。HbE是由β珠蛋白基因第26位的谷氨酸被赖氨酸取代所产生，是一种β地贫样的血红蛋白病[7]。HbE存在时，同样可对HbA2定量。毛细管区带电泳对血红蛋白变异体的分辨效果好，用此方法分离血红蛋白，可对与α地中海贫血相关的血红蛋白血症进行鉴别诊断[8-9]。全自动毛细管电泳法且具有样品处理简单、自动化程度高、检测时间短等优势[10]。所以我们认为全自动毛细管电泳法基本可以为地中海贫血及血红蛋白病筛查及诊断提供快速准确的诊断依据。但在实际应用过程中应注意以下几点：①标本采集后应在7 d内完成测定，电泳前放置冰箱2℃～8℃保存，否则对HbCS、HbH、Hb Bart's等的不稳定的血红蛋白易造成降解。②毛细管电泳分析无法检出α地贫-1和α地贫-2，所以对血常规Hb、MCV、MCH降低的患者，在排除缺铁性贫血、自身免疫性溶血等因素后，HbF、HbA2值正常且未检出异常区带者，应做分子生物学检测地贫基因来排除轻型α地贫患者。③对电泳出现有A2变异体或其他异常血红蛋白的标本可以结合软件中给出的区带提示去初步分析和判断，对异常区带的最后诊断要进行基因分析测序确认。

[1]张新华,周英杰,李平萍,等.广西南宁市农村育龄人群地中海贫血筛查及基因型和血液学参数分析[J].中华流行病学杂志,2006,27（9）:769-772.

[2]李 霞,杨 林,杨承东,等.地中海贫血的筛查与产前诊断[J].中国优生与遗传杂志,2008,16（2）:43,78.

[3]周艳洁,朱茂灵,丁进龙,等.广西横县9346对育龄夫妇地中海贫血干预结果分析[J].中华检验医学杂志,2011,34（8）:1-3.

[4]Yang ZH,Chaffin CH,Easley PL,et al.Prevalence of elevated hemoglobinA2 measured by the CAPILLARYSSystem[J].Am JClin Pathol,2009,131:42-48.

[5]陈 星,卢业成,初德强,等.全自动毛细管电泳系统在HbF检测中的应用[J].实用医学杂志,2009,25（14）:2359-2360.

[6]董卫华,王 俐,张俊河,等.一种PCR结合DNA回收克隆基因方法[J].重庆医学,2011,40（14）:1433-1434.

[7]朱 凌,罗瑞贵,周天红,等.广西地区β地中海贫血基因突变类型分析[J].华南国防医学杂志,2009,23（2）:41-43.

[8]Louahabi A,Philippe M,Lali S,et al.Evaluation of a new Sebia kit for analysis of hemoglobin fractions and variants on the Cap illarys system[J].Clin Chem Lab Med,2006,44（3）:340-345.

[9]卢业成,郑师陵,肖艳华,等.全自动多通道毛细管区带电泳技术在血红蛋白分析中的临床应用[J].国际检验医学杂志,2009,30（7）:675-676,679.

[10]陈 燕,黄泽玉,王雅杰,等.全自动多通道毛细管区带电泳法在血清蛋白分析中的临床应用[J].中华检验医学杂志,2006,29（5）:420-423.