RNAi沉默PSA基因对人前列腺癌细胞系LNCaP生长的影响

徐建明，何永忠，雷 鸣，吴文起，李 逊，黄锦昆，杨后猛，桂志明，钟 文，李 天，曾国华，李舒珏

(广州医学院港湾医院广东省泌尿外科重点实验室，广东 广州 510230)

当前的流行病学研究显示，前列腺癌在欧美国家的发病率明显高于我国，已经成为男性恶性肿瘤的第一位，而我国的前列腺癌的发病率也呈现出逐年上升的趋势[1]。前列腺特异抗原(PSA)是一种包含240个氨基酸的单链糖蛋白，分子量为34 kD。正常前列腺上皮、增生前列腺组织及前列腺癌细胞均能产生PSA。但在前列腺癌患者PSA水平明显高于良性前列腺增生患者及正常老年人。PSA在前列腺癌筛选、诊断、治疗方法的选择、疗效评估以及监测复发等方面已广为应用[2-3]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在多种生物细胞内，由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导同源序列mRNA的特异性降解，而导致的基因沉默现象[4]。随着RNA干扰技术的兴起与发展，特异性地使某个基因在转录后沉默成为可能，因而成为前列腺癌基因治疗的又一新的有前途的靶向策略[5]。

我们采用RNA干扰技术阻断PSA基因表达，减少PSA的形成，降低其活性，研究PSA基因表达受抑制后对LNCaP细胞的生长、增殖及调亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人前列腺癌细胞株LNCaP由广东省泌尿外科重点实验室冻存；RPMI1640培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；特异性干扰RNA由上海吉玛公司合成；TurboFect™ siRNATransfection Reagent购自Ferments公司；兔抗人PSA抗体购自EPITOMICS公司；四氮甲基唑蓝(MTT)购自Sigma公司。

1.2 细胞的冻存和培养 人雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞株由广东省泌尿外科重点实验室保存，10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2培养箱内培养，取对数生长期的细胞实验。

1.3 干扰RNA的构建与转染 根据人PSA基因序列及文献报道，结合siRNA的设计原理提交上海吉玛公司合成PSA siRNA序列：正义链，5'-GUGCGAGAAGCAUUCCCAATT-3'；反义链，5'-UUGGGAAUGCUUCUCGCACTT-3'。阴性对照序列：正义链，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；反义链，5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'。用TurboFectTMsiRNA Transfection Reagent转染液将PSA-siRNA及阴性对照分别转入LNCaP细胞，具体的操作步骤按TurboFect™siRNATransfection Reagent转染试剂说明书进行。

1.4 蛋白印迹检测PSA的变化 转染后48 h取对数生长期的LNCaP细胞，提取总蛋白并定量，蛋白印迹(Western blot)检测PSA的表达，以GAPDH的表达作为内参，并利用PHOTOSHOP图像分析系统分析结果。

1.5 MTT法检测LNCaP细胞的生长与增殖取对数生长期的LNCaP细胞以1×106/孔的密度接种于96孔培养板中培养，分4组进行实验：转染组(siPSA)、阴性对照组(NC)、转染液组(Transfection)和对照组(Control)，每组设3个复孔。转染48 h后，每孔按10%的体积比加入5 mg/ml MTS试剂，继续培养4 h后，弃去上清，每孔加入100μl的DMSO，然后以490 nm波长经酶标仪测定各孔吸光度(OD)值，并计算出细胞增殖抑制率。实验重复三次。

1.6 流式细胞仪检测形态学分析 转染48 h后，收集各组细胞并用PBS漂洗，进行Annexin-V-FITC-PI荧光染色，制成单细胞悬液，应用流式细仪检测细胞凋亡情况。实验重复三次。

1.7 统计学方法 应用SPSS 13.0软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PSA-siRNA转染后LNCaP细胞中PSA的表达 蛋白印迹检测结果显示与空白组相比，PSA-siRNA转染48 h后。转染组LNCaP细胞株内PSA的表达明显降低，转染组与阴性对照组、转染液组及对照组LNCaP细胞株内PSA的表达组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，阴性对照组、转染液组和对照组比较，组间差异无统计学意义(P＞0.05)(图1)。

2.2 MTT分析PSA-siRNA转染后对LNCaP细胞生长与增殖的抑制作用与阴性对照组、转染液组和对照组相比，转染48 h后PSA-siRNA转染组的LNCaP细胞数减少约27.5%(表1)。

图1 转染48 h后LNCaP细胞中PSA及GAPDH的蛋白印迹分析结果

表1 转染48 h后LNCaP细胞增殖情况[细胞个数（%）]

2.3 流式细胞仪检测PSA-siRNA转染后对LNCaP细胞调亡的影响 与阴性对照组、空白载体转染组和对照组相比，转染48 h后转染组的LNCaP细胞调亡率约为19.3%(表2、图2)。

表2 转染48 h后LNCaP细胞调亡率（%）

图2 转染后流式细胞仪检测结果

3 讨 论

迄今对于处于进展期和晚期的前列腺癌仍没有有效的治疗方法。对于中晚期的前列腺癌，目前可以选择的治疗方法有内分泌治疗、化学治疗、放射治疗，而基因治疗是目前的研究热点。尽管目前基因治疗的方法和途径多种多样，但是仍然没有发现十分有效的治疗方法，故而各国学者一直没有中断寻找更为有效的基因治疗方法。

PSA是一种酸性糖蛋白酶，由240个氨基酸多肽单链与4个碳水键构成，相对分子量为33000～34000。控制PSA基因位于19号染色体长臂上，含5个外显子、4个内含子和3个启动子。PSA有调节生长因子的作用，在恶性细胞中的含量明显高于正常和增生的细胞，已经作为公认的前列腺癌肿瘤标记物有20余年的历史。

RNAi现象最早在1998年由Fire等[6]发现并命名。随后的研究发现RNAi机制广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌、植物以及哺乳动物等生物体内，这些生物体利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。之后RNA干扰技术成为基因治疗研究的热点。siRNA是一类长度为21～23 nt的小片段双链RNA。近年来研究发现，siRNA可特异识别有靶基因转录的mRNA，并切割其中与siRNA反义链互补的区域，从而抑制靶基因的表达[7]。利用这种RNA干扰技术封闭某些目的基因，阻止相应蛋白的表达，不仅具有理论意义，而且具有重要的实际应用价值[8]。

本研究运用化学合成法构建了针对PSA基因的小分子干扰RNA(PSA-siRNA)，将PSA-siRNA转染入LNCaP细胞，并设立了阴性对照组、转染液组和对照组。本实验的研究结果显示，PSA-siRNA转染组的LNCaP细胞的生长与增殖受到明显抑制，LNCaP细胞的调亡显著增加。而阴性对照组、转染液组和对照组差异并无统计学意义。由此我们可知，针对PSA基因的siRNA具有一定的特异性。

蛋白印迹显示PSA蛋白表达在siPSA组明显降低，MTT分析结果显示siPSA组的细胞生长受到明显抑制，流式细胞仪检测siPSA组的调亡率更高。实验数据提示，PSA-siRNA可以抑制LNCaP细胞的生长与增殖，并增加调亡，为前列腺癌的RNA干扰治疗提供了一个新的靶点，其机制需进一步研究。

[1]Jemal A,Siegel R,ward E,et al.Cancer statistics,2009[J].CA Cancer JClin,2009,59(4):225-249.

[2]Wang MC,Valenzucla LA.Mushy GP,et al.Pantication of a human prostated specific antigen[J].Invest Urol,1979,179(1):159-161.

[3]Shariat SF,Karam JA,Roehrborn CG.Blood biomarkers for prostate cancer detection and prognosis[J].Future Oncol,2007,3(4):449-461．

[4]缪应业,刘家云,田晋洪,等.RNA干扰技术及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用[J].国际泌尿系统杂志,2006,26(2):169-172.

[5]Maitland NJ.Targeting Therapeutic Gene Expression to Human Prostate Cancers[J].Curr Opinin Mol Ther,2000,2(4):389-399.

[6]Fire A.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[7]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexesof 21-nucleotide RNAs mediate RNA interfence in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411(6836):494-498.

[8]Sui G,Soohoo C,Affarel B,et al.A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2002,99(8):5515-5520.