不同处理凤仙花对瘤胃微生物体外产甲烷及发酵特性的影响

张志红 黄江丽 田晓娟 黄 黄 张国华 王东升 印遇龙 丁建南*

(1.江西省科学院生物资源研究所，南昌 330029;2.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125)

随着全球气候变暖形势的日益严峻，人们越来越关注温室气体的排放问题。甲烷(CH4)作为重要的温室气体之一，其温室效应是二氧化碳(CO2)的20～30倍。畜牧业对全球温室效应的贡献率为9% ～18%，而反刍动物排放的CH4约占其中的80%［1］。反刍动物瘤胃内生成的CH4不仅加剧了温室效应，同时也降低了饲料利用率，造成2% ～15%饲料总能的损失［2］。因此，研究降低瘤胃CH4排放的措施和新型添加剂已成为目前研究的热点之一。研究表明，抗生素、离子型载体等物质能有效改善瘤胃发酵，降低CH4产量［3］。但此类物质长期使用会导致微生物产生耐药性和药物残留，同时影响动物产品的品质，给动物或人类健康带来威胁。研究发现，一些植物提取物具有调节瘤胃微生物发酵，减少 CH4释放的效果［4－6］。因此，大力发掘植物提取物亦成为瘤胃CH4减排研究的热点［7－8］。凤仙花(Impatiens balsamina L.)是凤仙花科凤仙花属植物，为一年生草本植物，主要分布于热带地区及亚热带地区，在中国主要产于西南地区［9］。本课题组在筛选降CH4药用植物时发现，与青蒿、蒲公英等植物比较，凤仙花具有显著的降CH4效果［10］。目前国内外很少有关于凤仙花降低瘤胃CH4生成的报道，本试验采用体外厌氧培养技术，旨在通过研究不同处理凤仙花对瘤胃微生物CH4产生和发酵特性的影响，并通过对 CH4、氨态氮(NH3－N)以及微生物蛋白质(MCP)等特征指标的分析，初步评价凤仙花能否作为反刍动物降CH4植物。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料与人工饲料

凤仙花为江西省科学院生物资源研究所植物遗传育种研究室栽培，开花后期整株采收，全株风干后粉碎过1 mm筛成为固体粉剂。固体粉剂在50℃下分别在70%乙醇和蒸馏水中浸泡48 h，料液比为1∶4，浸泡之后用超声波提取，超声波频率为20 000 Hz，提取温度为50℃。通过抽滤得到粗提液，在60℃左右将粗提液浓缩到总体积的1/5，即为凤仙花水或乙醇浸提液。人工饲料选用稻草、玉米和黄豆，粉碎过1 mm筛备用。

1.1.2 瘤胃液

瘤胃液取自装有永久性瘤胃瘘管的黄牛，试验动物每天饲喂2次，饲喂时间为07:00和17:00，自由饮水。晨饲2 h后采集瘤胃瘘管中新鲜瘤胃液，迅速装入充有氮气的自封袋中，并用39℃保温瓶带回实验室。将采集的瘤胃液用4层脱脂纱布在大烧杯中过滤，过滤时在厌氧袋中操作，减少微生物与空气接触机会。量取所需体积的瘤胃液迅速加入到准备好的人工唾液中(瘤胃液与人工唾液体积比为1∶2)，制成混合人工瘤胃培养液，培养液在开始前新鲜配制。人工唾液的配制参照Menke等［11］的方法。

1.1.3 瘤胃体外培养装置

本研究使用的瘤胃体外培养装置是在王全军等［12］所用培养体系的基础上改造而成，装置由2部分组成，即培养瓶和50 mL全玻璃注射器(浙江宁波和平注射器厂)。培养瓶中放入培养液和人工饲料后，瓶口用反口胶塞和铝盖密封。在胶塞和铝盖上插入注射器，注射器接触的地方用密封带密封，同时注射器外围再用医用胶布固定。注射器每次使用之前洗净晾干，用凡士林涂沫注射器，减少注射器内腔和塞之间摩擦。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验设10个处理，即对照(无任何添加剂，CK);3个水平的凤仙花水浸提液，添加量分别是培养液装量的0.5%、1.0%和2.5%(W1、W2和W3);3个水平的凤仙花乙醇浸提液，添加量分别是培养液装量的0.5%、1.0%和2.5%(E1、E2和E3);3个水平的凤仙花固体粉剂，添加量分别是培养液装量的0.5%、1.0%和2.5%(S1、S2和S3)。每个处理设7个平行，每个培养瓶为1个平行，试验连续重复3个批次。

1.2.2 体外培养试验操作

分别称取稻草粉、玉米粉和黄豆粉0.90、0.45和0.15 g，组成体外培养所用人工饲料。将人工饲料送入250 mL培养瓶内，加入不同处理凤仙花制剂。在厌氧操作袋中打开培养瓶，分别向每个瓶中加入人工瘤胃培养液200 mL，与人工饲料混合均匀。迅速盖上胶塞和铝盖，用注射针头导入氮气，驱除瓶中空气，确保培养瓶内为厌氧环境，插上注射器(标注1 mL刻度)。将培养瓶放入(39.0±0.5)℃恒温培养箱中发酵培养24 h。12、18和24 h记录注射器读数，放空注射器再插回培养瓶。各个处理的注射器读数与校正对照(只有培养液没有饲料底物)比较后，转换成产气量。公式为:产气量=Vt－Vi，其中Vt为各处理发酵t小时的注射器读数，Vi为校正对照发酵t小时的注射器读数。发酵至终点后迅速测定瓶中CH4和CO2含量，收集各处理发酵液，测定pH、NH3－N和MCP含量。

1.2.3 测定方法

CO2和 CH4含量的测定:CO2含量用 GASBOARD沼气分析仪(武汉四方光电科技有限公司)测定;CH4含量用岛津气相色谱仪器测定:采用 HP－INNOWAX(19091N －133)毛细管柱，测定条件为柱温80℃、气化室温度100℃、检测室温度120℃，载气使用高纯氮气。用10 μL微量注射器分别抽取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL CH4标准气，根据CH4含量和其峰面积关系，确定CH4标准曲线，具体条件参照胡伟莲等［13］的方法。

发酵液参数测定:发酵液pH用梅特勒－托利多酸度计直接测定;NH3－N含量测定采用水杨酸钠－次氯酸钠比色法，具体过程参照冯宗慈等［14］的方法;MCP含量测定参照 Makkar等［15］分步离心法进行样品的预处理，采用考马斯亮蓝(G250)比色法进行测定。

1.3 统计分析

数据采用Excel 2003软件进行记录整理，统计分析采用SAS V8软件的Turkey法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，试验结果用平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵产气量的影响

从表1看出，不同处理的凤仙花体外培养瘤胃产气量不同。比较12 h产气量，CK产气量最低，S3比CK产气量提高了86.7%(P＜0.05)，且显著高于其他凤仙花处理(P＜0.05)。18 h产气量中，CK也是最低，S1、S2和S3均显著高于其他处理(P＜0.05)。24 h产气量中，CK依然最低，S1、S2、S3和 E3显著高于其他处理(P ＜0.05)。比较24 h累积产气量，固体粉剂处理均显著高于CK(P＜0.05)，平均为96.02 mL，比 CK提高了56.8%;E2和E3显著高于 CK(P＜0.05)，乙醇浸提液处理累积产气量平均为76.37 mL，比CK提高了24.7%;水浸提液仅W3累积产气量显著高于CK(P＜0.05)，3个处理平均为69.90 mL，比CK提高了14.1%。凤仙花不同处理中，添加量和产气量之间也表现出一定关系，添加量低，产气量低，添加量高时，产气量也相应提高。

表1 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵产气量的影响Table 1 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on gas production in vitro rumen fermentation

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。下表同。

In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，while with the same letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵CH4、CO2含量和pH的影响

不同处理凤仙花对体外培养CH4、CO2含量以及pH的影响见表2，CK CH4含量最高，而S3为0，完全抑制了CH4生成;S1、S2和E3 CH4含量小于1%，W1和W2与CK比较，没有显著差异(P＞0.05)。比较凤仙花不同添加量对CH4含量的影响可以发现，随着添加量增加，CH4含量越来越低。CO2含量变化与CH4相反，在所有处理中，CK最低，S3最高，S3比CK提高了88.5%(P＜0.05)。凤仙花3种添加方式中，固体粉剂对CO2含量提高最明显，平均比CK提高了64.9%，其次是乙醇浸提液，平均比CK提高了36.1%，水浸提液效果较差，平均比CK提高了11.2%。随着添加量的增加，CO2含量提高十分明显。pH变化趋势与CH4相同，CK最高，S3最低，并且差异显著(P＜0.05)。凤仙花不同处理中，固体粉剂降低pH最明显。

2.3 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵NH3－N含量的影响

NH3－N是瘤胃微生物发酵一个重要参数，反映了瘤胃代谢状态。不同处理凤仙花对NH3－N含量的影响见表3，CK最高，S3最低，差异显著(P＜0.05)。NH3－N含量整体变化趋势与CH4相似，添加量相同时，凤仙花固体粉剂降低最明显。随着添加量的增加，NH3－N含量降低越明显，S1、S2和S3分别比CK降低了41.1%(P＜0.05)、52.2%(P ＜0.05)和 55.4%(P ＜0.05)，E1、E2和E3分别比CK降低了12.8%(P＞0.05)、29.7%(P ＜0.05)和 48.2%(P ＜0.05)，W1、W2和W3分别比CK降低了5.9%(P＞0.05)、6.2%(P＞0.05)和42.9%(P＜0.05)。

表2 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵CH4、CO2含量和pH的影响(24 h)Table 2 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on CH4，CO2contents and pH in vitro rumen fermentation(24 h)

表3 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵NH3－N和MCP含量的影响(24 h)Table 3 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on NH3－N and MCP contents in vitro rumen fermentation(24 h)

2.4 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵MCP的影响

从表3看出，体外发酵液中CK的MCP含量最低，凤仙花固体粉剂处理的MCP含量高，S1、S2和S3分别比CK提高了84.9%(P＜0.05)、139.7%(P＜0.05)和199.7%(P＜0.05);E1、E2和E3分别比CK提高了60.0%(P＜0.05)、77.4%(P＜0.05)和94.8%(P＜0.05);水浸提液对MCP提高效果比乙醇浸提液差，W1、W2和W3分别比CK提高了4.5%(P＞0.05)、30.5%(P＞0.05)和43.1%(P＜0.05)。在凤仙花相同处理中，随着添加量的增加，MCP含量逐渐提高。

3 讨论

3.1 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵产气量以及CH4和CO2含量的影响

研究结果表明，产气量越高，瘤胃内的发酵活动越剧烈，对反刍动物的促进作用越明显［16］。从试验结果看，凤仙花不同处理对体外瘤胃发酵有一定影响，与CK比较，从开始到培养结束，凤仙花均可以刺激瘤胃微生物发酵代谢活动，提高瘤胃产气量，添加量高时效果越明显。凤仙花对CH4和CO2含量的影响相反，CH4含量均比CK低，这可能是与CH4生成受到抑制时，引起CO2和氢气(H2)等的累积有关［17］，其中原因以及瘤胃中产CH4微生物的变化特征还有待进一步研究。研究发现，莫能菌素具有明显降低CH4生成的效果，但是在饲粮中莫能菌素含量较高时抑制CO2产生，影响瘤胃微生物代谢活动，初步分析两者降甲烷作用方式可能不同。

3.2 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵pH的影响

瘤胃液pH是反映瘤胃内发酵状况的一项综合指标。瘤胃微生物以瘤胃为其直接的生长环境，pH过高或过低对瘤胃微生物的正常生长、发育及发酵均有不利的影响。通常认为正常的瘤胃pH变化范围为6～7，当pH低于6时，纤维分解菌和原虫数量将减少，饲粮中纤维素和蛋白质的降解率就会降低［18］。在本试验中体外发酵24 h各处理pH均大于6，pH的变化范围未超出瘤胃微生物的最适生长范围。随着不同处理凤仙花添加量的增加，pH有降低的趋势，但对瘤胃发酵没有产生不利影响。添加凤仙花引起pH降低，分析原因可能是凤仙花改变了瘤胃微生物发酵方式，引起挥发性脂肪酸(VFA)等物质增加，又由于采用不连续体外培养方式，造成代谢产物不能及时排出而累积［19］。

3.3 不同处理凤仙花对体外瘤胃发酵NH3－N和MCP含量的影响

瘤胃液中NH3－N是瘤胃氮代谢过程中外源蛋白质和内源含氮物质降解的重要产物，同时也是瘤胃微生物合成MCP的原料，它反映了瘤胃内微生物氮的供应状况［20］。MCP代谢是瘤胃微生物区系营养代谢的一个重要组成部分，是反刍动物最主要的氮源供应者，它可以满足动物营养需要量的40%～80%。由于体外培养没有瘤胃壁对NH3－N 的吸收、分泌等的影响，所以 NH3－N 的含量主要取决于2个方面:一方面是瘤胃微生物降解饲粮中的含氮化合物为NH3－N的能力，另一方面是瘤胃微生物利用NH3－N合成MCP的能力。本试验中，体外培养24 h后，添加凤仙花各处理的NH3－N含量不同程度低于 CK，降低了5.8% ～55.4%;MCP含量相反，凤仙花处理均比CK高，比CK增加了4.5%～199.7%。结果表明，凤仙花处理刺激了瘤胃微生物代谢活动，促进NH3－N向MCP转化，加快了MCP的合成，这个结果与前人报道茶皂素等植物提取物具有减少瘤胃NH3－N含量、促进MCP合成［21］的结论一致。

3.4 凤仙花不同处理方式瘤胃发酵效果比较

比较凤仙花水和乙醇浸提液以及固体粉剂体外瘤胃发酵效果，从CH4、CO2和MCP含量等数据看，添加量相同时，固体粉剂的效果最好，水浸提液效果最差。直接添加固体粉剂，其中的糖、蛋白质等营养物质也可被微生物利用，促进瘤胃发酵，因此效果更好。凤仙花乙醇浸提液效果比水浸提液好，这表明降CH4有效成分极性较弱，更容易被有机溶剂浸提。因此，在以后研究中可以选用不同有机溶剂浸提凤仙花，比较体外培养降甲烷效果，并分析有效成分的性质和结构。

4 结论

①不同处理凤仙花均能有效降低CH4产生，促进NH3－N向MCP转化，添加量高(2.5%)时效果更明显。

②比较水浸提液、乙醇浸提液和固体粉剂体外培养效果，固体粉剂最好。

③凤仙花有望成为新的降CH4植物。

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