啤酒糟部分替代豆粕对水牛体外瘤胃发酵特性和甲烷生成的影响

黄雅莉 邹彩霞 黄连莹 梁贤威 夏中生* 韦升菊 梁 辛

(1.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005;2.中国农业科学院广西水牛研究所，南宁 530001)

啤酒糟是一种以大麦为原料，经发酵提取籽实中部分可溶性碳水化合物生产啤酒后剩下的副产品，其蛋白质含量高，过瘤胃蛋白质含量高，矿物质、维生素含量丰富。此外，其适口性好，价格低廉，货源较充足，是奶牛的理想饲料。近年来，随着畜牧业的快速发展，饲料资源特别是蛋白质饲料日趋紧缺，开发利用饲料资源，降低饲养成本，已成为世界各国共同关心的问题。用富含蛋白质的啤酒糟作为奶牛饲粮蛋白质源具有以下的优点:1)节约饲料;2)可以代替部分精饲料，以减少饲料成本;3)减少热应激。

目前已有许多学者在啤酒糟饲喂牛方面做了一些研究报道。王星凌［1］在荷斯坦奶牛饲粮中添加枣、大豆皮和鲜啤酒糟，结果表明这种低成本的饲粮有助于提高产奶量、乳成分和经济效益。薛志成［2］利用干啤酒糟代替饲粮中20%的精饲料饲喂泌乳牛，结果表明饲喂干啤酒糟组产奶量比对照组减少1.6%，差异不显著，但是每头牛每天多盈利0.64元，经济效益十分显著。孙桂芬［3］用啤酒糟饲喂泌乳中后期奶牛，结果表明饲粮中添加啤酒糟不仅可以减缓泌乳中后期奶牛产奶量的下降幅度，而且每头每天饲喂添加啤酒糟饲粮的奶牛产出净利润比不添加啤酒糟的奶牛增加0.424元。王海滨［4］报道啤酒糟饲喂奶牛，当精饲料喂量为7.20 kg、鲜啤酒糟喂量达到10.30 kg时，奶牛平均泌乳单产最高(14.45 kg)，毛利润为13.68元/(头·d);当精饲料喂量为6.10 kg、鲜啤酒糟喂量达到11.70 kg时，毛利润为15.02元/(头·d)，该研究表明，奶牛饲粮中添加10 kg左右的鲜啤酒糟可提高产奶量，并降低饲养成本，对泌乳中后期奶牛饲喂效果尤为显著，对牛的健康无不良影响。

啤酒糟在作为蛋白质饲料部分替代精饲料饲喂动物的研究报道比较少。因而，更深层次的开展这方面的应用研究工作十分重要。本试验利用啤酒糟蛋白质含量高的这一特性，通过采用体外产气的方法，在体外条件下研究饲粮中啤酒糟以不同水平替代豆粕对水牛瘤胃发酵功能及甲烷产量的影响，确定啤酒糟替代豆粕的可行性及最佳的替代水平，以缓解我国日益紧缺的蛋白质饲料资源，也为今后开展啤酒糟在反刍动物营养研究应用中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用豆粕、玉米、啤酒糟、玉米秸秆、象草和美国苜蓿均采自广西水牛研究所，经65℃烘干制成风干样后粉碎过40目筛。经过分析测定，本试验采用的啤酒糟干物质含量为25.82%，粗蛋白质含量为30.41%，中性洗涤纤维含量为62.60%，酸性洗涤纤维含量为13.55%，粗纤维含量为9.07%，钙含量为0.31%，磷含量为0.53%。

1.2 试验设计

设计发酵底物的精粗比为4∶6(风干基础)，其中玉米25%、豆粕15%、玉米秸秆30%、象草30%。啤酒糟以0、25%、50%、75%和100%(风干基础)替代发酵底物中的豆粕。体外产气试验发酵底物见表1。另设1个空白对照组和1个标准干草美国苜蓿组，标准干草美国苜蓿组用于消除试验误差，在所有时间点的产气试验结束后，对所测的结果都采用标准干草的测定值进行校正，以消除试验误差。此外，如果试验标准干草的实测值与标准值差异很大时，要重新进行发酵培养。

1.3 试验方法

1.3.1 体外培养体系

本试验采用Mauricio等［5］的压力读取式体外产气系统(reading pressure system)进行体外瘤胃发酵，厌氧人工瘤胃缓冲液的配制参照Theodorou等［6］的方法。体外培养装置主体为恒温水浴摇床。培养底物为750 mg(干物质基础)，培养时间为72 h。1.3.2 瘤胃液供体动物及其饲养

表1 体外发酵底物(风干基础)Table 1 Substrates for in vitro fermentation(air－dry basis) %

选择3头体重为(400±5)kg安装有永久性瘤胃瘘管的水牛作为瘤胃液的供体动物。饲粮参照广西水牛研究所的日常饲养配方配制，精粗比为3∶7(风干基础)，粗饲料为象草。饲粮营养水平为粗蛋白质13.72%、产奶净能6.44 MJ/kg、钙0.72%、磷0.48%。瘘管牛采用栓系式饲养，每日于08:00和17:00各饲喂1次，自由饮水，常规光照、驱虫及管理。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 产气量(gas production，GP)的测定

产气量测定参考Theodorou等［6］的方法，分别于培养2、4、6、9、12、24、36、48、72 h 时用压力传感器读取产气瓶内压力，并放气。根据以下公式计算出产气量:

式中:GPt为样品在t时刻的产气量(mL/g)，Pt为样品在t时刻读取的压力(mPa)，Pt空白为空白对照在t时刻的产气压力(mPa)，V0为瓶子体积(mL)，101.3为标准大气压(mPa)，W为样品干物质质量(mg)。

产气过程的累积产气量为各时间段产气量之和。

根据以下公式计算出各部分产气量:

GP=a+b(1－e－ct)。

式中:GP为产气量(mL/g)，a为快速产气部分产气量(mL/g)，b为慢速产气部分的产气量(mL/g)，c为产气速率常数(h－1)，a+b 为潜在产气量(mL/g)，t为培养时间(h)。

1.4.2 可消化有机物含量和代谢能的测定

以200 mg(干物质基础)底物为单位进行发酵，根据体外产气法培养24 h后得到的产气量计算可消化有机物，计算公式如下:

DOM=(7.65 ±0.062)GP24h+(353 ±0.59)［7］。

式中:DOM为可消化有机物(g/kg)，GP24h为24 h累积产气量(mL/g)。代谢能计算公式如下:

DO=17.04+1.108 5GP24h;ME= －0.200 0+0.141 0DO［8］。式中:DO为有机物消化率(%)，ME为代谢能(MJ/kg)。

1.4.3 氨态氮浓度的测定

取体外发酵培养24 h后的培养液5 mL，经过3 000 × g 离心10 min，取上清液，采用 Searle［9］、冯宗慈等［10］的改进方法，用氯化铵作标准品，采用紫外可见分光光度计(PE Lambda 35型，美国)在700 nm波长条件下比色，根据光密度值和标准曲线求出氨态氮的浓度。

1.4.4 微生物蛋白质浓度的测定

取体外发酵培养24 h后的培养液8 mL，采用嘌呤法测定体外微生物蛋白质产量，经过处理后的待测液以0.5 mol/L盐酸溶液作参比，采用紫外可见分光光度计(PE Lambda 35型，美国)在260 nm下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值，根据以下公式计算微生物蛋白质产量:

微生物蛋白质(mg/mL)=［RNA测定值(mg/mL)×RNA含氮量(%)/

细菌氮中RNA含氮量(%)］×

稀释倍数 ×6.25［8］。

式中，RNA含氮量为17.83%，细菌氮中RNA含氮量为10%。

1.4.5 挥发性脂肪酸浓度的测定

取体外发酵培养24 h后的上清液1 mL，加入等体积8.2%的偏磷酸，4℃ 20 000×g下离心10 min，取离心后的上清液加入内标物巴豆酸，仪器为Agilent 7890A型气相色谱仪，色谱柱为HPINNOWAX(19091N－133)毛细管柱，规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm。测定上清液中乙酸、丙酸和丁酸的浓度。

1.4.6 甲烷产量的测定

分别在培养6、12、24 h时各抽取10 μL气体用手动式进样法用Agilent 7890A型气相色谱仪测定甲烷产量，色谱柱为HP－INNOWAX(19091N－133)毛细管柱，规格为30 m ×0.25 mm ×0.25 μm。

1.5 数据统计处理

试验数据用 Excel软件进行处理，然后用SPSS 16.0软件进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，试验数据用平均值±标准误表示，以P＜0.05作为差异显著性判断的标准。

2 结果

2.1 72 h内产气量、72 h累积产气量、可消化有机物含量和代谢能

由图1和表2可知，72 h累积产气量、可消化有机物含量和代谢能这3个指标随着啤酒糟替代比例的增加而呈降低趋势。72 h累积产气量0组与25%组、50%组之间差异不显著(P＞0.05)，这3个组与75%组差异显著(P＜0.05)，与100%组差异极显著(P＜0.01)。可消化有机物含量和代谢能各个组之间差异显著(P＜0.05)。

图1 啤酒糟替代不同比例豆粕对72 h内产气量的影响Fig.1 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on GP in 72 h

表2 啤酒糟替代不同比例豆粕对72 h累积产气量、可消化有机物含量和代谢能的影响Table 2 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on accumulation of GP in 72 h，digestible organic matter content and metabolisable energy

同行数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相间小写字母表示差异极显著(P＜0.01)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values with adjacent letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with alternate letter superscripts mean significant difference(P＜0.01)，while with the same letter superscript mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

由表3可知，快速产气部分产气量、慢速产气部分产气量、潜在产气量和产气速率常数都随着啤酒糟替代比例的增加而呈降低趋势，变化不显著(P＞0.05)。

表3 啤酒糟替代不同比例豆粕对各组分产气量的影响Table 3 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on GP of constituents

2.2 氨态氮和微生物蛋白质浓度

由表4可知，氨态氮、微生物蛋白质浓度随着啤酒糟替代比例的增加而总体呈降低趋势。氨态氮浓度25%组最高，极显著高于50%组和75%组(P＜0.01)，这2组之间差异不显著(P＞0.05)，0组与25%组差异不显著(P＞0.05)。微生物蛋白质浓度0组最高，次之依次为50%组、25%组、100%组和75%组，0组与25%组、50%组差异不显著(P＞0.05)，与75%组差异极显著(P＜0.01)，与100%组差异显著(P＜0.05)。

2.3 挥发性脂肪酸浓度

由表5可知，乙酸浓度25%组最高，次之依次为50%组、0组、100%组、75%组，25%组显著高于0组、100%组和75%组(P＜0.05)。丙酸、总挥发性脂肪酸浓度均以25%组最高，且25%组均显著高于75%组、100%组(P＜0.05)。丁酸浓度25%组最高，次之依次为75%组、0组、50%组、100%组，25%组显著高于100%组(P＜0.05)。乙酸/丙酸25%组最高，显著高于0组和75%组(P＜0.05)。

由表6可知，6 h 75%组甲烷产量最高，显著高于0组、25%组、50%组(P＜0.05)，这3组之间差异不显著(P＞0.05)。12和24 h甲烷产量随着啤酒糟替代比例的增加而呈增加趋势。12 h甲烷产量0组与25%组、50%组差异不显著(P＞0.05)，它们均显著低于其他2组(P＜0.05)。24 h甲烷产量0组与25%组差异不显著(P＞0.05)，它们显著低于50%组(P＜0.05)并极显著低于75%组、100%组(P＜0.01)。

2.4 甲烷产量

表4 啤酒糟替代不同比例豆粕对氨态氮、微生物蛋白质浓度的影响Table 4 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on concentrations of ammonia nitrogen and microbial protein

表5 啤酒糟替代不同比例豆粕对挥发性脂肪酸浓度的影响Table 5 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains atdifferent ratios on concentrations of volatile fatty acids

表6 啤酒糟替代不同比例豆粕对甲烷产量的影响Table 6 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on methane production mmol

3 讨论

3.1 啤酒糟替代不同比例豆粕对产气量、可消化有机物含量、代谢能的影响

产气量作为综合反映饲料的可发酵程度指标，不仅能表现瘤胃中微生物活动的总体趋势，还是能反映饲料蛋白质营养价值的综合指标［11］。产气量的多少反映了饲草的可消化性的大小，它与饲料中有机物的发酵程度成正相关，饲料的可发酵性越强，瘤胃中微生物的活性越高，产气量就越大，反之则越少。易贤武［12］进行了西兰花茎叶粉不同比例替代豆粕的体外瘤胃发酵研究，结果表明随着西兰花茎叶粉替代水平的增加，0～72 h累积产气量逐渐下降。本试验72 h累积产气量各组之间依次降低，与上述研究结果相一致。可消化有机物含量和代谢能是根据24 h产气量计算出来的，它们与24 h产气量成正比关系，所以这2个指标也是随替代比例增加依次降低。产气量中慢速产气部分产气量、潜在产气量及产气速率常数0组与50%组相差均不大。

3.2 啤酒糟替代不同比例豆粕对氨态氮、微生物蛋白质浓度的影响

氨态氮是瘤胃内饲料肽、氨基酸、蛋白质、尿素、氨化物及其他非蛋白氮分解的终产物，同时也是瘤胃微生物合成菌体蛋白质的主要原料［13］。瘤胃中氨态氮的浓度过高或过低都不利于微生物的生长繁殖，因此保持瘤胃液中最适氨态氮浓度是保证微生物蛋白质合成的首要条件。Lees等［14］发现奶牛补饲蛋白质饲料能提高氨态氮的浓度。夏楠等［15］研究发现采用豆粕、棉粕、菜籽粕的饲粮山羊瘤胃液氨态氮浓度显著高于采用玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)的饲粮，这与前三者的蛋白质含量比DDGS高有关。王梦芝等［16］研究羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕和鱼粉对瘤胃微生物体外发酵的影响，结果表明氨态氮浓度豆粕组最高，羽毛粉组最低。从本试验结果可以看出，随着啤酒糟替代豆粕比例的增加，氨态氮浓度显著下降，这与啤酒糟的蛋白质含量低于豆粕有关。本试验与上述研究结果相一致。

微生物蛋白质是反刍动物最主要的氮源供应者，能提供动物蛋白质需要的40% ～80%。微生物蛋白质浓度反映了微生物利用氨态氮的能力;微生物蛋白质浓度也间接地反映了培养体系中微生物种群的数量。从本试验结果可以看出，0组微生物蛋白质与25%组、50%组差异不显著，但与75%组差异极显著、与100%组差异显著。本试验结果表明，啤酒糟作为水牛蛋白质饲料在0～50%替代豆粕对体外发酵特性无显著影响。

3.3 啤酒糟替代不同比例豆粕对挥发性脂肪酸浓度的影响

瘤胃碳水化合物发酵的主要产物是乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸。它们是反刍动物主要的能量来源及合成乳脂和体脂的原料。挥发性脂肪酸的产量及其比例可显著影响反刍动物对营养物质的吸收、利用和生产性能的发挥。易贤武［12］研究西兰花茎叶粉不同比例替代豆粕，结果表明随着西兰花茎叶粉替代豆粕的比例增加，总挥发性脂肪酸浓度下降，但对乙酸、丙酸和丁酸浓度都无显著影响。本试验研究结果与上述研究结果相一致。

3.4 啤酒糟替代不同比例豆粕对甲烷产量的影响

瘤胃内甲烷是有机物发酵的必然产物之一。瘤胃内甲烷的产生既是能量的损失，同时也是造成温室效应的主要原因之一。饲粮中粗饲料比例越高，甲烷产量越高［17］。Lovett等［18］认为，提高奶牛饲粮精饲料比例能降低甲烷的生成量。本试验在6和12 h 0组甲烷产量与25%组、50%组差异不显著。12和24 h甲烷产量随着替代比例的增加而呈增加趋势。本试验结果可以看出啤酒糟作为粗饲料，它替代豆粕的比例越高，产生的甲烷量也越高，饲粮中粗饲料比例越高，甲烷产量越高的研究结果一致。

4 结论

①啤酒糟0～50%替代豆粕对体外瘤胃发酵及甲烷产量无显著性影响。

②啤酒糟50%～100%替代豆粕降低了产气量、可消化有机物含量、代谢能、微生物蛋白质浓度、挥发性脂肪酸浓度，并显著提高甲烷产量。

③啤酒糟作为水牛蛋白质饲料0～50%替代豆粕为宜。

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