酵母核苷酸对团头鲂生长性能、抗氧化功能和抗病力的影响

张一平 刘 波 华洵璐 孙 梅 谢 骏* 史济筠

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，无锡 214081;2.江苏省苏微微生物研究有限公司，无锡 214063;

3.江苏省宜兴市天石饲料有限公司，宜兴 214258)

核苷酸是生物体内一类低分子化合物，是构成生物大分子核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的基本组分，几乎参与细胞的所有生化过程，具有调节生物体能量代谢、参与遗传信息编码、传递细胞信号等重要的生理和生化功能［1］。生物体通过从头合成和补救这2种途径合成内源核苷酸。从头合成途径是由多种小分子如二氧化碳、氨、核糖、甘氨酸、嘌呤和嘧啶等，经一系列酶催化反应逐步组装而成;补救途径是以食物吸收和体内核酸分解所提供的碱基为原料，经酶促磷酸化而成。从头合成是核苷酸合成的主要方式，但需消耗相当高的能量。外源核苷酸除直接提供核苷酸外，还可增加补救途径的核苷酸生成量，并反馈抑制从头合成途径而起到节能作用［2］。研究表明，当动物处于快速生长期、肝功能障碍、免疫应激等特殊生理条件下时，内源核苷酸合成相对不足，此时需要来源于饲料的外源核苷酸加以补充［3］。因此，核苷酸被称为半必需营养物质或条件营养物质，是一类极有发展前途的新型饲料添加剂［4］。

外源核苷酸可促进动物的生长和提高免疫功能［5－6］已经被证实。王锐等［7－8］在异育银鲫幼鱼饲料中添加500 mg/kg等量混匀的纯度≥90%的5种核苷酸——腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、胞苷酸(CMP)、肌苷酸(IMP)、鸟苷酸(GMP)，结果发现，该混合核苷酸能显著提高异育银鲫幼鱼的增重率和特定生长率，降低饲料系数，改善鱼体的脂肪代谢，提高鱼体的非特异性免疫功能，同时还能提高鱼体中各种消化酶的活性。也有采用有效成分含量为8.6%的酵母核苷酸(具体成分未公布)作为外源添加剂进行研究的。例如:王广军等［9］在凡纳滨对虾饲料中添加344 mg/kg时能显著促进对虾生长，提高机体抗应激能力和免疫能力;周兴华等［10］在锦鲤幼鱼饲料中添加387 mg/kg时能显著提高锦鲤幼鱼增重率、特定生长率，降低饲料系数;魏文志等［11］在异育银鲫饲料中添加344 mg/kg时能显著促进异育银鲫的生长，并降低饲料系数，添加172 mg/kg时能显著提高异育银鲫血清中溶菌酶和碱性磷酸酶活性。

目前国内肌苷和鸟苷的发酵水平很高，以此为原料合成的IMP和GMP比较便宜［12］;而AMP、UMP、CMP仍只能从酵母中提取，提取成本较高。因此，添加纯核苷酸会增加养殖成本，降低养殖户的经济效益;而8.6%的酵母核苷酸因有效成分含量低，不便于饲料配方的设计。鉴于此，本试验拟采用介于两者之间的第3种剂型，即有效成分含量为70%的酵母核苷酸(具体成分参见材料与方法)，以我国淡水养殖的大宗品种——团头鲂(俗称武昌鱼、鳊鱼)为试验对象，研究该剂型核苷酸对鱼体生长性能和抗氧化功能的影响，同时采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒试验，研究该剂型核苷酸对鱼体抗病力的影响，为核苷酸在水产养殖中的应用提供更进一步的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用酵母核苷酸由江苏省苏微微生物研究有限公司提供，从酵母细胞中提取，有效成分含量为 70%(AMP 8.72%、GMP 9.67%、CMP 6.80%、UMP 8.11%、低聚核苷酸36.70%)。

1.2 试验饲料

基础饲料参考我国水产行业标准SC/T 1074—2004配制，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸(按照受试物的量计算，即1 kg基础饲料中加入200 mg有效成分含量为70%的酵母核苷酸)作为试验饲料。各种原料分别粉碎过60目筛，先将磷酸二氢钙、凹凸棒土、沸石粉、预混料等混匀，再加大料逐级充分混匀，后加适量水，用小型绞肉机制成粒径为2.0 mm的湿颗粒饲料，晾干备用。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)维生素预混料为每千克饲料提供Vitamin premix provided the following per kg of diet:VC 150 mg，VE 100 mg，VK35 mg，VA 2 000 IU，VB110 mg，VB220 mg，VB610 mg，VB120.05 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 100 mg，叶酸 folic acid 5 mg，生物素 biotin 1 mg，肌醇 inositol 500 mg，烟酸 niacin 150 mg。

2)矿物质预混料为每千克饲料提供Mineral premix provided the following per kg of diet:CuSO4·5H2O 52.5 mg，FeSO4·7H2O 28 mg，ZnSO4·7H2O 22 mg，MnSO4·4H2O 9 mg，Na2SeO30.045 mg，KI 0.026 mg，CoCl2·6H2O 0.1 mg。

1.3 试验动物

试验用团头鲂由中国水产科学院淡水渔业研究中心渔场提供。选择健康且规格、重量基本一致的团头鲂300尾，个体初始体重为(31.46±0.07)g。将所选试验鱼随机分成2组(对照组和核苷酸组)，每组3个重复，每个重复50尾，以重复为单位放养于规格为1.00 m×1.00 m×1.00 m的网箱内。对照组试验鱼饲喂基础饲料(核苷酸主要来自于鱼粉，含量仅为60 mg/kg左右)，核苷酸组试验鱼饲喂试验饲料(基础饲料+200 mg/kg酵母核苷酸)。

1.4 饲养管理

试验在中国水产科学院淡水渔业研究中心无锡南泉试验基地完成。团头鲂在网箱驯养30 d后开始投喂试验饲料，投饲率为鱼体重的2% ～4%，每天投喂 2次，在 08:00—08:30、16:00—16:30各投喂1次。试验期间每天08:00和16:00各测水温1次，每周测1次水质，保持水温在(25.0±1.5)℃，溶氧≥6 mg/L，氨氮≤0.1 mg/L，pH 6.8～7.0。每天观察鱼摄食及死亡情况，并根据实际情况每隔1周增加投饲量。正式试验时间为56 d。

1.5 攻毒试验

饲养试验结束后，分别从对照组和核苷酸组中选择大小基本一致的鱼30尾进行攻毒试验，每组分3个重复，每个重复均为10尾鱼。病原菌为浙江省淡水水产研究所提供的嗜水气单胞菌BSK－10株。按王文博等［13］所述方法，将2次活化后的嗜水气单胞菌用无菌生理盐水稀释，使其终浓度约为2×108个/mL。根据每100 g鱼腹腔注射菌液1.0 mL的标准进行注射(例如:50 g鱼，注射0.5 mL;40 g鱼，注射0.4 mL)，注射后以重复为单位放养于容积为200 L的玻璃缸中，并保证充足的氧气，每天观察鱼体死亡情况，观察1周，统计不同时间点的累积死亡率。

1.6 指标测定与方法

1.6.1 生长和形体指标的测定

饲养试验结束后，称量每个网箱团头鲂总重，以计算生长指标。在每个网箱中随机抽取3尾鱼，量取体长、体重以及肝脏重，以计算形体指标。1.6.2 血液生理生化指标的测定

饲养试验结束后，每个重复取3尾鱼，将鱼迅速捞起并立即投入浓度为200 mg/L的3－氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐溶液中快速深度麻醉;将2 mL注射器管壁用肝素润湿，尾静脉采血;血样在4℃冰箱静置1～2 h，于4℃、3 000 r/min下离心10 min制备血浆，血浆移入－20℃保存备测。

血浆总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖(GLU)含量均采用比色法测定，试剂盒购自卫生部上海生物制品研究所;甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)含量均采用酶法测定，试剂盒购自上海名典生物工程有限公司;谷草转氨酶(GOT)和碱性磷酸酶(AKP)活性均采用比色法测定，试剂盒购自骏实生物科技(上海)有限公司;抗超氧阴离子水平采用比色法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。上述指标均使用美国贝克曼Cx－4型全自动生化分析仪进行测定。

1.6.3 相关指标的计算公式

存活率(SR，%)=100×(初始鱼尾数－

死亡鱼尾数)/初始鱼尾数;摄食率(FR，%/d)=100×干物质摄入量/［试验天数×(初始体重+终末体重)/2］;

特定生长率(SGR，%/d)=100×(ln初始体重－ln终末体重)/试验天数;

蛋白质效率(PER，%)=100×(初始体重－

终末体重)/蛋白质摄入量;

饲料系数(FCR)=饲料消耗量/鱼体增重量;肝体比(HSI，%)=100×肝脏重/鱼体重;内脏比(VSI，%)=100×内脏重/鱼体重;肥满度(CF，%)=100×鱼体重/鱼体长3;累积死亡率(CMR，%)=100×(初始鱼尾数－

终末鱼尾数)/初始鱼尾数。

1.7 数据统计与分析

所有数据均采用SPSS 11.5统计软件进行分析处理，采用Student氏t检验法比较组间的差异性，P＜0.05表示差异显著。所有结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 酵母核苷酸对团头鲂生长性能的影响

由表2可知，与对照组相比，核苷酸组的特定生长率和蛋白质效率显著提高(P＜0.05)，分别比对照组提高了9.52%和14.72%;饲料系数显著降低(P＜0.05)，比对照组降低了10.99%;摄食率虽有所降低，但差异不显著(P＞0.05)。这说明，饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸后能促进鱼体生长，提高饲料利用率。

表2 酵母核苷酸对团头鲂生长性能的影响Table 2 Effects of yeast nucleotide on growth performance of buntnose black bream

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。下表同。

In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，while with the same small letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 酵母核苷酸对团头鲂形体指标和存活率的影响

由表3可知，与对照组相比，核苷酸组在各项形体指标(肝体比、内脏比、肥满度)以及存活率上均未发生显著变化(P＞0.05)，说明饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸后不会造成团头鲂形体的改变，不会影响团头鲂的存活率。

表3 酵母核苷酸对团头鲂形体指标和存活率的影响Table 3 Effects of yeast nucleotide on body indices and survival rate of bluntnose black bream %

2.3 酵母核苷酸对团头鲂血液生理生化指标的影响

2.3.1 酵母核苷酸对团头鲂免疫和抗氧化指标的影响

由表4可知，与对照组相比，核苷酸组的血浆碱性磷酸酶活性无显著变化(P＞0.05)，但有微弱的增加(增加幅度为6.97%)。核苷酸组的血浆抗超氧阴离子水平与对照组相比有了显著提高(P＜0.05)，提高幅度达41.29%，说明饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸能显著地增强团头鲂的抗氧化功能。

表4 酵母核苷酸对团头鲂免疫和抗氧化指标的影响Table 4 Effects of yeast nucleotide on immune and antioxidant indices of bluntnose black bream U/L

2.3.2 酵母核苷酸对团头鲂肝功能指标的影响

由表5可知，与对照组相比，核苷酸组的各项肝功能指标均未产生显著变化(P＞0.05)，说明200 mg/kg的酵母核苷酸添加量不影响团头鲂的肝功能。

表5 酵母核苷酸对团头鲂肝功能指标的影响Table 5 Effects of yeast nucleotide on liver function indices of bluntnose black bream

2.3.3 酵母核苷酸对团头鲂血脂和血糖指标的影响

由表6可知，与对照组相比，核苷酸组的血脂和血糖指标均未产生显著变化(P＞0.05)，说明200 mg/kg的酵母核苷酸添加量不影响团头鲂的血脂和血糖代谢。

表6 酵母核苷酸对团头鲂血脂和血糖指标的影响Table 6 Effects of yeast nucleotide on blood lipid and glucose indices of bluntnose black bream mmol/L

2.4 酵母核苷酸对团头鲂抗病力的影响

*表示与对照组相比差异显著(P＜0.05)。* means significant difference compared with the control group(P＜0.05).图1 酵母核苷酸对嗜水气单胞菌攻毒团头鲂累积死亡率的影响Fig.1 Effects of yeast nucleotide on cumulative mortality rate of bluntnose black bream challenged with Aeromonas hydrophila

3 讨论

3.1 核苷酸对团头鲂生长性能的影响

国内学者已证实了核苷酸对锦鲤［10］、异育银鲫［11］、梭鲈［14］、斑点叉尾［15］、尖吻鲈［16］等鱼种的促生长作用，虽其适宜添加量因配方背景、鱼种及核苷酸剂型不同而有很大差异，但一般在100～700 mg/kg范围内。本文选用团头鲂作为试验对象，按照酵母核苷酸200 mg/kg的添加量进行试验，也得到了类似的结果。其作用机理主要是:外源核苷酸能提供鱼体快速生长时细胞复制所需的核苷酸［17］;可使代谢酶活性增强，诱导激素或酶的合成［18］;能提高肠道消化酶活性，刺激胰蛋白酶分泌［8］;能使鱼类肠皱壁基底膜厚度和肠道表面积增加，肠道折叠高度提高［19］。本文仅设计了200 mg/kg的酵母核苷酸添加量，该添加量是综合了已有的文献报道，并结合添加成本等因素决定的，结果表明该添加量能促进团头鲂的生长，但未能得到该剂型核苷酸针对团头鲂的最佳添加量，因此还需要做进一步研究。

3.2 核苷酸对团头鲂免疫功能的影响

外源添加核苷酸能增强鱼类的免疫功能，是因为鱼体的免疫细胞缺乏通过从头合成途径合成核苷酸的能力，必须依靠已经合成好的外源核苷酸［20－21］。向 枭 等［6］研 究 表 明，饲 料 中 添 加519.85～774.00 mg/kg核苷酸能提高鲤鱼血清溶菌酶、超氧化歧化酶和过氧化氢酶的活性;王锐等［7］研究表明，饲料中添加500 mg/kg核苷酸能提高异育银鲫幼鱼的非特异性免疫功能;魏文志等［11］研究表明，饲料中添加172 mg/kg核苷酸能提高异育银鲫血清中碱性磷酸酶和溶菌酶活性。本研究表明，饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸对团头鲂血浆碱性磷酸酶活性虽无显著影响，但

由图1可知，在嗜水气单胞菌攻毒试验中，在发生应激12 h后，2组试验鱼均开始出现死亡。在12～24 h，对照组试验鱼的累积死亡率明显高于核苷酸组，且死亡率的增加趋势也明显快于核苷酸组;48 h后，核苷酸组累积死亡率不再增加，而对照组累积死亡率的增加一直持续到96 h时。在整个攻毒试验期间，对照组试验鱼12～168 h的累积死亡率为55.56%～72.22%(平均值为61.66%)，核苷酸组试验鱼12～168 h的累积死亡率为16.671% ～44.44%(平均值为28.33%)。96～168 h的累积死亡率，对照组与核苷酸组之间存在显著差异(P＜0.05)，说明添加量为200 mg/kg的酵母核苷酸可增强团头鲂对嗜水气单胞菌感染的抵抗能力。有增加趋势。本研究结果与上述研究结果存在一定差异，这是否与试验鱼种、饲料组成、试验条件、核苷酸的剂量及剂型不同有关，还需要进一步研究。

3.3 核苷酸对团头鲂抗氧化功能的影响

动物体内存在有一定数量的超氧阴离子自由基，其不发生化学变化时对动物体无害，但与羟基(—OH)结合后的产物会导致细胞DNA被损坏，进而破坏机体功能。抗超氧阴离子能清除超氧阴离子自由基，使超氧阴离子自由基的产生与消除处于一个动态平衡状态，从而减少超氧阴离子自由基对机体自身的损伤［9］。本试验研究表明，饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸显著提高了团头鲂血浆中抗超氧阴离子水平，说明团头鲂的抗氧化功能得到增强。但关于核苷酸增强团头鲂抗氧化功能的作用机理还不十分清楚，有待进一步深入研究。

3.4 核苷酸对团头鲂形体、肝功能以及血脂和血糖指标的影响

目前，国内外关于核苷酸的研究多集中于其对动物生长性能、免疫功能、应激、消化功能和体组成方面的影响。本文针对核苷酸对团头鲂形体(主要为肝体比、内脏比、肥满度)以及肝功能、血脂和血糖指标的影响进行了初探性研究，结果表明饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸对上述指标均未产生显著影响。核苷酸是生物体内本身含有的物质，不被生物体排斥。有学者认为，动物摄入过多的核酸类物质会造成核酸代谢紊乱，血液中尿酸浓度上升，引起痛风病［2］;但也有学者认为，鱼类肝脏中含有较高浓度的尿酸酶，可将尿酸转化为尿囊素，再降解为尿素和乙醛酸并从尿中排泄出去，所以能耐受较高剂量的核苷酸［1］。关于鱼类饲料中核苷酸的添加量到底多少才合适，还需要做更详细地试验，本研究的结果仅证明酵母核苷酸200 mg/kg的添加量不会影响团头鲂的形体发育、肝功能以及血脂和血糖代谢。

3.5 核苷酸对团头鲂抗病力的影响

核苷酸作为免疫增强剂，通过刺激水生动物非特异性免疫反应达到预防传染性疾病的目的［22－24］。本研究通过对团头鲂进行嗜水气单胞菌攻毒试验，证明饲料中添加200 mg/kg酵母核苷酸能明显降低团头鲂的累积死亡率;并且核苷酸组的累积死亡率延续时间明显比对照组缩短(大约缩短了48 h)，这种时间上的缩短可能与外源添加核苷酸后使团头鲂的免疫功能和抗病力迅速增强有关。国外有研究用鳗弧菌、传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼立克次体、海洋寄生虫分别感染大西洋鲑鱼，结果发现饲料中添加300 mg/kg核苷酸能显著降低大西洋鲑鱼的累积死亡率［25］。本研究所得结果与国外的研究结果是相近的，至于添加量的差异，可能与试验鱼种、饲料组成和试验条件不同有关，还需要进一步研究。

3.6 关于酵母核苷酸剂型的选择

将5种纯核苷酸(纯度≥90%)等量混合的剂型，其中的AMP、UMP、CMP需从酵母核酸的酶解液中经繁琐的提取工艺才能得到，生产成本较高，增加了添加成本;而8.6%酵母核苷酸剂型，不需经过核苷酸的提纯工艺，生产成本低廉，但有效成分含量低，影响养殖效果，也不便于饲料配方的设计。本研究采用的是有效成分(单体核苷酸+低聚核苷酸)含量达70%的酵母核苷酸，其中含有的低聚核苷酸被认为具有特殊的生理保健功效［26］，其生产成本介于前2种剂型之间。但究竟何种剂型既能使养殖效果最好，又能使经济效益最显著，还需进行更详细的对比研究。

4 结论

饲料中添加200 mg/kg的酵母核苷酸能在一定程度上促进团头鲂的生长，增强鱼体的抗氧化功能和抗病力，且不会影响鱼体肝功能以及血脂和血糖代谢。

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