苏氨酸对体外培养感染伪狂犬病毒猪空肠上皮细胞免疫相关基因表达的影响

韩国全 余 冰，2 陈代文，2* 相振田 陈渝 陈洪 毛倩

(1.四川农业大学动物营养研究所，雅安 625014;2.四川农业大学动物抗病营养教育部重点实验室，雅安 625014)

苏氨酸(threonine，Thr)由学者 Rose 等［1－3］在20世纪30年代年通过关于氨基酸组成的动物饲养试验中预测并证实的，而且从纤维蛋白质水解混合物中首次获得纯分离物，因其空间结构与苏糖相似而命名。苏氨酸是动物饲粮中的第二或第三限制性氨基酸，具有突出的生理功效，对其研究一直是动物营养研究领域中的热点之一。良好的免疫功能是动物获得最佳生产性能的基础，而良好的营养水平亦是动物获得最佳免疫水平的基础。苏氨酸在氨基酸营养中具有关键作用，同时对免疫的影响也较大，近年来其在分子营养与免疫领域引起了相关学者的极大关注。Fuller等［4］与Stoll等［5］报道健康的肠道可吸收截留来自饲粮中60% ～80%苏氨酸，与其他肠道蛋白质相比，肠道黏膜蛋白中尤其富含苏氨酸(占其氨基酸组成的30%)。Wang等［6］在研究人工感染大肠杆菌的断奶仔猪时观察到，增加饲粮中的苏氨酸含量，抗体产量增加，血清中免疫球蛋白G(IgG)浓度以及回肠黏膜中IgG和免疫球蛋白(IgA)的浓度均有所提高，同时降低了回肠黏膜中白介素6(IL－6)的含量。Faure等［7］通过研究氨基酸合成代谢反应对苏氨酸的利用率发现，小鼠感染败血症时对苏氨酸需要的增幅高于其他必需氨基酸。Remond等［8］利用迷你猪动物模型，考察急性回肠炎应激下胃肠道苏氨酸摄入与黏液素的合成特点，结果显示小肠苏氨酸水平对黏膜蛋白和黏液素合成影响较大，肠内补充苏氨酸显著减轻临床肠道炎症。疫病应激下机体快速合成大量的急性期蛋白和免疫球蛋白，这些蛋白的氨基酸组成不同于机体组织，苏氨酸的比例要高于机体组织，因此，它的需要量大幅增加。

IPEC－J2细胞是分离自未吮乳的新生仔猪空肠上皮细胞，属于非转化性最初的连续培养小肠细胞系，具有典型的猪小肠上皮细胞特性［9］，因此，IPEC－J2细胞可以作为极好的小肠体外模型用以研究营养物质与小肠上皮细胞的作用机制。猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科甲疱疹病毒亚科，主要特征是宿主范围广，有高度的细胞致病性且复制周期短。研究证实多数杂交瘤细胞系和原代细胞都适合PRV的培养，实验室多用PK－15或SK－6细胞，PRV诱导的致细胞病变(CPE)一般出现在攻毒后的24～72 h。PRV感染致病时，所有被波及的组织均呈灶性坏死。Narita等［10］研究发现PRV感染在小肠发生黏膜上皮灶性坏死病变时，可能波及至黏膜肌层和外膜，核内包涵体见于受损的肠上皮细胞，胞核发生明显的固缩和核碎裂。作者将PRV接种IPECJ2细胞，72 h观察到细胞呈典型“拉网状”和细胞脱落的CPE，病毒检测阳性，证实PRV能够成功感染IPEC－J2细胞。本研究以 IPEC－J2细胞为小肠细胞体外模型，考察补充不同水平苏氨酸对感染PRV的细胞免疫相关基因表达的影响，旨在从分子水平深入理解苏氨酸对小肠上皮细胞免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验毒株与细胞株

PRV野毒株Fa株:四川农业大学动物医学院预防兽医学实验室繁殖冻存;IPEC－J2细胞:四川农业大学动物营养研究所猪营养实验室繁殖冻存。

1.1.2 主要试剂

苏氨酸以L－苏氨酸形式添加，为美国Sigma公司产品;总RNA提取试剂(TRIzolReagent)为美国Invitrogen公司产品;反转录试剂(iScriptTMcDNA Synthesis Kits)、定量 PCR试剂(SoFastTMEvaGreenSupermix)均为美国 Bio－Rad公司产品;细胞基础培养基［DMEM/F－12(1∶1)］干粉、胎牛血清(FCS)、细胞消化液(0.25%trypsin－EDTA)均为美国HyClone公司产品;相对分子质量标准DL2000为大连宝生物公司产品;核酸染料(GoldViewTM)为北京赛百胜基因技术有限公司产品;其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器

电热水浴二氧化碳细胞培养箱(Thermo Scientific Revco UltimaⅡ)为美国Thermo公司产品;超纯水仪(Milli－Q)为美国Millipore公司产品;倒置生物显微镜(TS100－F)为日本Nikon公司产品;实时荧光定量PCR仪(CFX096)、梯度PCR仪(MyCycler Thermal Cycler)、凝胶成像系统(GEL DOC2000)、稳压电泳仪(PowerPac Universal)均为美国Bio－Rad公司产品;高速冷冻离心机(Allegra 64R)为美国Beckman Coulter公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

本试验选用IPEC－J2细胞模型，分为4组，对照组未经伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV感染、苏氨酸浓度为53.45 mg/L，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组，经PRV感染，苏氨酸浓度分别为53.45、106.90、160.35 mg/L。每组3个重复，每个重复4孔。

1.2.2 试剂配制

基础培养基:取12.1 g(1袋)细胞基础培养基干粉溶于950 mL超纯水中，超纯水冲洗包装袋3～5次，磁力搅拌溶解，加入1.2 g碳酸氢钠和适量4－羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液调整pH至7.0左右，定容至1 000 mL，不锈钢滤器(孔径0.22 μm)过滤除菌，分装并抽样无菌检验，置于4℃避光保存。

完全培养基:无菌操作将胎牛血清按照10%(体积比)加入到基础培养基，置于4℃避光保存。

苏氨酸储备液(53.45 g/L):称取1.069 0 g L－苏氨酸，室温(20℃)下溶于20 mL基础培养基中，0.22 μm 过滤除菌，以 1.5 mL/管分装于2.0 mL无菌离心管，－20℃避光保存。

补充苏氨酸的培养基:将苏氨酸储存液恢复至室温，混匀，按合适比例加入到基础培养基中，分别配制苏氨酸浓度为 53.45、106.90、160.35 mg/L的培养基，置于4℃避光保存。

1.2.3 细胞常规培养

IPEC－J2细胞采用完全培养基培养，2～3 d更换1次培养基，待80%～100%融合时用细胞消化液消化传代，培养瓶置于37℃、5%CO2电热水浴二氧化碳细胞培养箱培养，每天定时观察细胞生长情况。

1.2.4 病毒增殖与滴度测定

采用IPEC－J2细胞增殖PRV，离心过滤收集病毒液。同时使用IPEC－J2细胞测定PRV的病毒滴度，采用 Reed－Muench两氏法［12］计算病毒组织半数感染量(TCID50)。

1.2.5 PRV感染与苏氨酸处理

将消化后的IPEC－J2细胞采用完全培养基稀释悬液至 5.0×105个/mL，以 200 μL/孔接种于12孔细胞培养盘，共接种4盘。置于37℃、5%CO2电热水浴二氧化碳细胞培养箱培养，每天定时观察细胞，24 h更换1次培养基。待75% ～85%融合时，吸除培养基，使用基础培养基洗涤2～3次后，对照组每孔分别加入200 μL基础培养基，试验组则每孔分别加入200 μL PRV病毒稀释液(1 TCID50/μL)，平均到4个盘上;置于 37℃、5%CO2中吸附1 h，每15 min匀速摇振细胞培养盘以确保充分吸附病毒;完全吸除各孔中液体，使用基础培养基洗涤2次，每孔分别加入相应补充L－苏氨酸的培养基800 μL，置于37℃、5%CO2孵育。IPEC－J2细胞的PRV感染、苏氨酸补充见表1。

分别于加入处理培养基后1、6、12、24 h取相应培养盘细胞，吸除上清，每孔加入0.5 mL总RNA提取试剂，室温裂解细胞5～10 min后转移至无菌1.5 mL离心管中，置于－75℃冻存备用。1.2.6 细胞总RNA的制备和反转录

参照总RNA提取试剂说明书，提取细胞总RNA，并用脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)处理制备的细胞总RNA样品，置于－75℃冻存备用。反转录参照反转录试剂说明书进行，cDNA产物置于－20℃冻存备用。

1.2.7 实时定量PCR

采用猪持家基因(housekeeping gene)β－肌动蛋白(β－actin)作为内参基因。登录美国NCBI网站，从GenBank数据库检索并下载保存猪的白介素 1β(IL－1β)、IL－6、白介素 15(IL－15)、肿瘤坏死因子 α(TNF－α)、转化生长因子 β1(TGF－β1)及 βactin的基因序列。综合应用软件Oligo 7.0与Primier 5.0自行设计实时定量PCR引物，引物序列及参数见表2。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。实时定量PCR、产物回收及TA克隆均参照文献［11］相关方法操作，TA克隆质粒交由上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。

表1 IPEC－J2细胞的伪狂犬病病毒感染、苏氨酸补充Table 1 PRV infection and Thrsupplementation of IPEC－J2 cell

采用10倍倍比稀释的方法将PCR产物的重组质粒稀释成系列标准品，以此标准品为模板进行实时定量PCR，每个稀释度样品做2个技术性重复，根据阈值循环(Ct)以及相应标准品的稀释度制作标准曲线。实时定量PCR反应体系如下:SoFastTMEvaGreenSupermix 10.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物 1.0 μL，RNase/DNase－free water 7.0 μL，cDNA 1.0 μL，总体积 20.0 μL;扩增参数为:95 ℃预变性30 s，95℃ 3 s，60～65℃(具体参考每个基因的退火温度)3 s，40个循环;溶解曲线参数为:65～95℃，每5 s上升0.5℃。所有基因表达量均以β－肌动蛋白为内参基因，以相对表达量来表示，相对定量数据的计算采用Pfaffl［13］建立的方法。

1.3 数据分析处理

数据采用Excel进行整理，以平均值±标准误表示。采用SPSS 17.0统计软件进行分析，采用GLM下Univariate程序进行双因素方差分析。

2 结果

苏氨酸对体外培养感染PRV的IPEC－J2细胞免疫相关基因表达的影响见表3。

表2 实时定量PCR引物序列及参数Table 2 Sequences and parameters of primers for the real－time PCR

IL－1β mRNA检测结果显示:与对照组相比，PRV感染显著降低了Ⅰ组 IL－1β mRNA表达量(P=0.040)，时间(P=0.127)、时间与PRV感染交互作用(P=0.333)的影响均不显著;PRV感染极显著降低了Ⅱ组 IL－1β mRNA表达量(P=0.001)，时间(P=0.051)、时间与PRV感染交互作用(P=0.165)的影响均不显著;随培养时间增加，Ⅲ组IL－1β mRNA表达量极显著地提高(P=0.000)，PRV感染极显著降低了IL－1β mRNA表达量(P=0.002)，时间与PRV感染交互作用的影响极显著(P=0.005)。PRV感染的3组相比，随时间增加，IL－1β mRNA表达量极显著地提高(P=0.000);苏氨酸水平(P=0.830)、时间与苏氨酸水平交互作用(P=0.249)的影响均不显著。

IL－6 mRNA检测结果显示:与对照组相比，时间(P=0.090)、PRV 感染(P=0.162)、时间与PRV感染交互作用(P=0.075)对Ⅰ组 IL－6 mRNA表达量的影响均不显著;随培养时间增加，Ⅱ组IL－6 mRNA表达量极显著地先升高后降低(P=0.014)，PRV感染(P=0.619)、时间与PRV感染交互作用(P=0.812)的影响均不显著;随培养时间增加，Ⅲ组IL－6 mRNA表达量极显著地先升高后降低(P=0.000)，PRV感染(P=0.346)、时间与PRV感染交互作用(P=0.142)的影响均不显著。PRV感染的3组相比，时间的影响不显著(P=0.587);随苏氨酸水平增加，IL－6 mRNA表达量极显著地先升高后降低(P=0.002);时间与苏氨酸水平交互作用的影响显著(P=0.012)。

IL－15 mRNA检测结果显示:与对照组相比，时间均极显著先升高后降低3个试验组的IL－15 mRNA表达量(P=0.000)，PRV感染均极显著提高了 IL－15 mRNA 表达量(P=0.000)，时间与PRV感染交互作用亦均极显著(P=0.000)。PRV感染的3组相比，随培养时间增加，IL－15 mRNA表达量极显著地先升高后降低(P=0.000);随苏氨酸水平升高，IL－15 mRNA表达量极显著地提高(P=0.000);时间与苏氨酸水平交互作用的影响亦极显著(P=0.000)。

TNF－α mRNA检测结果显示:与对照组相比，PRV感染极显著提高了Ⅰ组TNF－α mRNA表达量(P=0.000)，时间(P=0.451)、时间与PRV感染交互作用(P=0.072)的影响均不显著;时间(P=0.002)的增加、PRV感染(P=0.000)均极显著提高了Ⅱ组TNF－α mRNA表达量，时间与PRV感染交互作用的影响显著(P=0.043);时间(P=0.034)的增加、PRV感染(P=0.000)分别显著、极显著提高了Ⅲ组TNF－α mRNA表达量，时间与PRV感染交互作用的影响不显著(P=0.106)。PRV感染的3组相比，随培养时间增加，TNF－α mRNA表达量极显著地先提高后降低(P=0.001);苏氨酸水平(P=0.113)、时间与苏氨酸水平交互作用(P=0.195)的影响均不显著。

TGF－β1 mRNA检测结果显示:与对照组相比，随培养时间增加，Ⅰ组TGF－β1 mRNA表达量极显著地提高(P=0.000)，PRV感染极显著提高了 TGF－β1 mRNA 表达量(P=0.006)，时间与PRV感染交互作用显著(P=0.042);随培养时间增加，Ⅱ组TGF－β1 mRNA表达量极显著地提高(P=0.001)，PRV感染(P=0.804)、时间与PRV感染交互作用(P=0.201)的影响均不显著;随培养时间增加，Ⅲ组TGF－β1 mRNA表达量极显著地提高(P=0.000)，PRV感染影响不显著(P=0.197)，时间与PRV感染交互作用的影响极显著(P=0.001)。PRV感染的3组相比，随培养时间增加，TGF－β1 mRNA表达量极显著地先升高后降低(P=0.000);苏氨酸水平的影响不显著(P=0.055)，时间与苏氨酸水平交互作用的影响显著(P=0.015)。

表3 苏氨酸对体外培养感染伪狂犬病毒的IPEC－J2细胞免疫相关基因表达的影响Table 2 Effects of Thr on immune－related gene expression of IPEC－J2 cell infected with pseudorabies virus in vitro

3 讨论

3.1 关于细胞模型的选择

机体胃肠道系统的单层上皮细胞起到重要的物理屏障作用，限制胃肠道中潜在有害微生物与肠道黏膜层外部分的接触。黏膜蛋白是机体先天免疫反应的重要物质，黏膜防御的初级防线，而胃肠道上皮细胞就覆盖1层丰富的黏膜蛋白，因此研究人员认为上皮细胞介导了先天免疫的早期反应［14］。因此，推测上皮细胞是目前研究营养物质与先天免疫关系可行性较高的细胞模型。文献报道显示，目前仅有3种永恒传代的猪肠道细胞株:IPEC－1、IPEC－J2［15］和 转 化 细 胞 系 IPI－2I［16］。IPEC－J2是非转化、非致瘤肠上皮细胞株，保持了天然分化特性并呈现与原始肠上皮细胞高度相似性［9］，因此作者认为IPEC－J2是研究营养物质与肠道细胞免疫关系优秀的细胞株。

3.2 补充苏氨酸对感染PRV的IPEC－J2细胞基因表达的影响

猪群伪狂犬病、猪瘟等烈性疫病对规模化养猪造成重大经济损失，改善饲喂模式、增强遗传抗病力、提高抵抗力和病原感染抵御能力是保障生产的关键。从营养的角度来看，饲料组成(氨基酸、能量和酶类)应能够提供激活相应反应的必需成分。苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸是猪非必需限制性氨基酸，猪群只能通过饲料来源获得这些氨基酸。苏氨酸对猪消化、免疫以及生殖系统生理功能均有重要作用［17］，因此研究特殊的生理状态——病原微生物攻击下，苏氨酸水平与免疫的关系具有重要意义。Wang等［18］研究显示，无论是饲粮苏氨酸过高还是不足，均减少了育肥猪机体生长组织蛋白质的合成，不利于机体健康。本研究选择IPEC－J2细胞模型，考察补充添加不同水平的苏氨酸对先天免疫相关基因表达的影响，从分子水平深入理解苏氨酸对猪小肠上皮细胞免疫功能的影响。

白介素1(IL－1)是一种炎症和免疫源性细胞因子，既能协同其他细胞因子促进B细胞与T细胞的活化还能诱导其他炎性因子的产生、黏附分子的表达、白细胞浸润的增加、诱导兴奋性氨基酸和自由基的产生，启动多种细胞因子级联反应等［19］。本试验结果表明，Ⅰ组与对照组相比，PRV感染下调IL－1β mRNA表达，随时间推移下调强度减弱;PRV感染的3组相比，添加苏氨酸加强PRV感染下调IL－1β mRNA表达的趋势，且高水平(160.35 mg/L)苏氨酸在1、6 h加强强度大于低(53.45 mg/L)、中水平(106.90 mg/L)，在12 h加强强度小于低、中水平，24 h则表现为略有上调趋势。上述结果提示，补充高水平苏氨酸在病毒感染早期抑制IL－1β mRNA的表达，随后抑制减弱，甚或上调其表达。

IL－6主要由单核细胞、巨噬细胞分泌，很少一部分由上皮细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等分泌［20］。IL－6具有复杂的生物学功能，在机体免疫应答中起重要作用，可引起免疫炎症反应，是一种肠道炎性标记物［21－22］。本试验结果表明，Ⅰ组与对照组相比，PRV感染在1、6、12 h下调IL－6 mRNA表达，24 h则表现为上调趋势;PRV感染的3组相比，添加苏氨酸缓解PRV感染下调趋势，在1、6、12 h缓解PRV感染对其下调作用，高水平缓解作用较强，24 h则表现为Ⅰ组上调趋势，Ⅲ组下调趋势，Ⅱ组与对照组表达持平。上述结果提示，补充高水平苏氨酸有利于减缓早期病毒感染肠道细胞致炎性，而后期表达水平的升高极可能源于病毒的过度增殖。

IL－15具有广泛的生物学功能，被视作先天性免疫和获得性免疫的重要桥梁因子之一［23－24］，在宿主抗病毒感染和恶性转化的早期防御方面起重要作用［25］。IL－15在机体组织中分布极为广泛，Grabstein等［26］采用Northern印迹法分析了各种组织和细胞中IL－15 mRNA的表达，结果显示其在人胎盘和骨骼肌中表达最丰富，在人心、肺、肾、单核巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、上皮细胞及骨髓基质细胞中也有不同程度的表达。Ashkar等［27－28］通过对小鼠的研究证实，IL－15 在机体先天性保护免受人Ⅱ型生殖器单纯疱疹病毒感染中起关键性作用。本试验结果表明，Ⅰ组与对照组相比，PRV感染上调IL－15 mRNA表达，随培养时间增加上调强度先强后弱;PRV感染的3组相比，添加苏氨酸有加强PRV感染的上调趋势，在6、12、24 h呈现浓度效应，其中6 h效果最为明显。上述结果提示，苏氨酸可上调IL－15 mRNA表达水平，发挥其抗病毒感染生物学效应。

TNF－α来源极广泛，体内的多种细胞均具有产生和释放TNF－α的能力［29］。随着研究的深入，TNF－α在抗感染方面的作用受到广泛关注，肠道疾病能发生时，促炎细胞因子的生成明显增加，其中TNF－α是一种重要的炎症递质，在启动和维持肠组织炎症中起着非常重要的作用［30］。TNF－α具有双重生物学效应，是维持动物机体自稳、抵御各种致病因子必不可少的免疫调节因子。在低浓度时，主要作为细胞自分泌及旁分泌的调节物，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复及调节炎症反应等;在高浓度时，TNF－α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。本试验结果表明，Ⅰ组与对照组相比，PRV感染对TNF－α mRNA的表达具有较强上调作用，随培养时间增加上调趋势先强后弱再强;PRV感染的3组相比，添加苏氨酸缓解PRV感染的上调趋势，Ⅱ组、Ⅲ组在1、24 h缓解强度大于Ⅰ组，在6 h则表现为缓解强度小于后者，在12 h缓解强度表现为Ⅰ组与Ⅲ组无显著差异，且小于Ⅱ组。目前发现的促炎细胞因子包括 IL－1、IL－6 和 TNF－α，其中最重要的促炎细胞因子是IL－1和TNF－α，本试验结果提示，补充高水平苏氨酸可能延缓或阻抑PRV感染IPEC－J2细胞的炎症效应，这与IL－1β mRNA表达变化基本一致。

TGF－β在体内外具有广泛的生物学功能，在维持细胞增殖、分化和凋亡平衡等方面具有十分重要的作用［31］。TGF－β在其基因家族中研究较为清楚，生长抑制是TGF－β特有的性质，TGF－β对大多数细胞的增殖具有抑制作用，尤其是上皮细胞、内皮细胞、淋巴样细胞和造血细胞。Moses等［32］通过系统性研究证实，在正常情况下TGF－β1的作用主要是抑制上皮细胞增殖。Bai等［33］研究认为，TGF－β1 在凋亡蛋白(Fas)/凋亡蛋白配体(FasL)诱导的肺上皮细胞凋亡中发挥着双重作用，当使用TGF－β1和FasL联合处理或使用FasL、TGF－β1依次处理后，肺上皮细胞A549凋亡显著增强;然而，使用TGF－β1延续持续处理肺上皮细胞A549，结果导致显著抑制Fas/FasL诱导的细胞凋亡效应。本试验结果表明，Ⅰ组与对照组相比，PRV感染后1、6 h对TGF－β1 mRNA表达无显著影响，PRV感染后12、24 h上调其表达;PRV感染的3组相比，添加高水平苏氨酸在1 h下调其表达且呈浓度效应，在6 h对其表达无显著影响，Ⅲ组在12 h表现加强PRV感染后上调其表达，Ⅱ组、Ⅲ组在24 h对PRV感染后上调表达有较强的缓解。上述结果提示，补充高水平苏氨酸抑制TGF－β1 mRNA表达，有利于IPEC－J2细胞增殖，抵抗病毒感染。

4 结论

补充苏氨酸对感染PRV的IPEC－J2细胞先天性免疫功能具有分子表达水平的调控作用，总体上能够抑制 IL－1β、TNF－α、TGF－β1 基因表达，加强IL－6、IL－15基因表达，但影响具有时间效应。致 谢

本试验工作在四川农业大学动物医学院预防兽医学实验室完成，特此感谢郭万柱教授提供的试验条件及PRV。本试验选用的IPEC－J2细胞，由丹麦哥本哈根大学生命科学院人类营养系Per Torp Sangild教授惠赠，特别感谢！

［1］ ROSE W C.Feeding experiments with mixtures of highly purified amino acids.Ⅰ.The inadequacy of diets containing nineteen amino acids［J］.The Journal of Biological Chemistry，1931，94:155 －165.

［2］ MCCOY R H，MEYER C E，ROSE W C.Feeding experiments with mixtures of highly purified amino acids.Ⅷ.Isolation and identification of a new essential amino acid［J］.The Journal of Biological Chemistry，1935，112:283 －302.

［3］ SIMONI R D，HILL R L，VAUGHAN M.The discovery of the amino acid threonine:the work of William C.Rose［J］.The Journal of Biological Chemistry，2002，277(37):E25.

［4］ FULLER M F，MILNE A，HARRIS C I，et al.Amino acid losses in ileostomy fluid on a protein－free diet［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1994，59(1):70 －73.

［5］ STOLL B，HENRY J，REEDS P J，et al.Catabolism dominates the first－pass intestinal metabolism of dietary essential amino acids in milk protein－fed piglets［J］.The Journal of Nutrition，1998，128(3):606 －614.

［6］ WANG X，QIAO S Y，LIU M，et al.Effects of graded levels of true ileal digestible threonine on performance，serum parameters and immune function of 10－25 kg pigs［J］.Animal Feed Science and Technology，2006，129(3/4):264 －278.

［7］ FAURE M，CHONE F，METTRAUX C，et al.Threonine utilization for synthesis of acute phase proteins，intestinal proteins，and mucins is increased during sepsis in rats［J］.The Journal of Nutrition，2007，137(7):1802－1807.

［8］ REMOND D，BUFFIERE C，GODIN J P，et al.Intestinal inflammation increases gastrointestinal threonine uptake and mucin synthesis in enterally fed minipigs［J］.The Journal of Nutrition，2009，139(4):720 －726.

［9］ SCHIERACK P，NORDHOFF M，POLLMANN M，et al.Characterization of a porcine intestinal epithelial cell line for in vitro studies of microbial pathogenesis in swine［J］.Histochemistry and Cell Biology，2006，125(3):293－305.

［10］ NARITA M，KUBO M，FUKUSHO A，et al.Necrotizing enteritis in piglets associated with Aujeszky’s disease virus infection［J］.Veterinary Pathology，1984，21(4):450－452.

［11］ 韩国全.含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用［D］.博士学位论文.雅安:四川农业大学，2009.

［12］ REED L J，MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints［J］.American Journal of Hygiene，1938，27(3):493 －497.

［13］ PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucleic Acids Research，2001，29(9):e45.

［14］ MONCADAD M，KAMMANADIMINTISJ，CHADEE K.Mucin and Toll－like receptors in host defense against intestinal parasites［J］.Trends in Parasitology，2003，19(7):305 －311.

［15］ BERSCHNEIDER H M.Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl［J］.Gastroenterology，1989，96:A41.

［16］ KAEFFER B，BOTTREAU E，VELGE P，et al.Epithelioid and fibroblastic cell lines derived from the ileum of an adult histocompatible miniature boar(d/d haplotype)and immortalized by SV40 plasmid［J］.European Journal of Cell Biology，1993，62(1):152－162.

［17］ LEONARD R P，SPEER V C.Threonine requirement for reproduction in swine［J］.Journal of Animal Science，1983，56(6):1345 －1353.

［18］ WANG X，QIAO S，YIN Y，et al.A deficiency or excess of dietary threonine reduces protein synthesis in jejunum and skeletal muscle of young pigs［J］.The Journal of Nutrition，2007，137(6):1442 －1446.

［19］ CASTELLANOS M，CASTILLO J，GARCIA M M，et al.Inflammation－mediated damage in progressing lacunar infarctions:a potential therapeutic target［J］.Stroke，2002，33(4):982 －987.

［20］ VAN SNICK J.Interleukin－6:an overview［J］.Annual Review of Immunology，1990，8:253 －278.

［21］ RADDATZ D，BOCKEMUHL M，RAMADORI G.Quantitative measurement of cytokine mRNA in inflammatory bowel disease:relation to clinical and endoscopic activity and outcome［J］.European Journal of Gastroenterology ＆ Hepatology，2005，17(5):547－557.

［22］ TURKAY C，KASAPOGLU B.Noninvasive methods in evaluation of inflammatory bowel disease:where do we stand now?An update［J］.Clinics(Sao Paulo)，2010，65(2):221 －231.

［23］ HIROMATSU T，YAJIMA T，MATSUGUCHI T，et al.Overexpression of interleukin－15 protects against Escherichia coli－induced shock accompanied by inhibition of tumor necrosis factor－alpha－induced apoptosis［J］.Journal of Infectious Diseases，2003，187(9):1442－1451.

［24］ YAJIMA T，NISHIMURA H，ISHIMITSU R，et al.Overexpression of IL－15 in vivo increases antigendriven memory CD8+T cells following a microbe exposure［J］.The Journal of Immunology，2002，168(3):1198－1203.

［25］ RODELLA L，ZAMAI L，REZZANI R，et al.Interleukin 2 and interleukin 15 differentially predispose natural killer cells to apoptosis mediated by endothelial and tumour cells［J］.British Journal of Haematology，2001，115(2):442 －450.

［26］ GRABSTEIN K H，EISENMAN J，SHANEBECK K，et al.Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin－2 receptor［J］.Science，1994，264(5161):965 －968.

［27］ ASHKAR A A，BLACK G P，WEI Q，et al.Assessment of requirements for IL－15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy［J］.The Journal of Immunology，2003，171(6):2937 －2944.

［28］ ASHKAR A A，ROSENTHAL K L.Interleukin－15 and natural killer and NKT cells play a critical role in innate protection against genital herpes simplex virus type 2 infection［J］.Journal of Virology，2003，77(18):10168－10171.

［29］ KAPADIA S，LEE J，TORRE－AMIONE G，et al.Tumor necrosis factor－alpha gene and protein expression in adult feline myocardium after endotoxin administration［J］.Journal of Clinical Investigation，1995，96(2):1042 －1052.

［30］ SU C，SALZBERG B A，LEWIS J D，et al.Efficacy of anti－tumor necrosis factor therapy in patients with ulcerative colitis［J］.The American Journal of Gastroenterology，2002，97(10):2577 －2584.

［31］ MOSES H L，YANG E Y，PIETENPOL J A.TGF－beta stimulation and inhibition of cell proliferation:new mechanistic insights［J］.Cell，1990，63(2):245 －247.

［32］ MOSES H L，ARTEAGA C L，ALEXANDROW M G，et al.TGF beta regulation of cell proliferation［J］.Princess Takamatsu Symp，1994，24:250 －263.

［33］ BAI L，YU Z，WANG C，et al.Dual role of TGF－beta1 on Fas－induced apoptosis in lung epithelial cells［J］.Respiratory Physiology ＆ Neurobiology，2011，177(3):241－246.