乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

章文明 汪海峰，2* 刘建新*

(1.浙江大学动物科学学院，生物饲料安全与污染防控国家工程实验室，杭州 310058;

2.浙江农林大学林业与生物技术学院，临安 311300)

乳酸杆菌能够调节肠道微生物区系的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力，促进肠道的生长和发育，是得到广泛应用的益生菌之一。国内外大量的饲养试验和临床试验证明了乳酸杆菌的益生作用，如治疗、预防人和动物的某些肠道疾病，发挥保健作用。但有关乳酸杆菌的益生作用机制仍然不清楚，已有研究者从分子水平去探索乳酸杆菌的促健康机制，并且取得了一定进展。本文综述了乳酸杆菌通过产生抗菌物质、竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌，通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡增强肠道的屏障功能，通过表面成分与肠道受体结合而调控肠道免疫功能，进而改善肠道健康的机制。

1 乳酸杆菌分泌产物及其对宿主健康的作用

1.1 乳酸

乳酸杆菌能产生乳酸，乳酸是一种重要的抗菌化合物［1］。研究表明，乳酸杆菌通过分泌的乳酸来螯合金属离子等和改变革兰氏阳性菌细胞膜通透性来发挥作用，乳酸还能降低肠道pH，抑制大肠杆菌及梭菌等生长，例如，由于乳酸的积累，鼠李糖乳酸杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)对鼠伤寒沙门氏菌有很强的抗菌活性［2］。干酪乳杆菌、嗜酸乳酸杆菌YIT0070和短乳杆菌YIT0076产生的非解离乳酸能够有效地抑制大肠杆菌生长［3］。乳酸能改变革兰氏阳性菌细胞膜通透性。研究发现，加氏乳酸杆菌(L.gasseri CRL1421)产生的乳酸能使金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞膜瓦解，使其细胞内容物渗出，从而对其起到抑制作用［4］。

1.2 过氧化氢(H2O2)

乳酸杆菌能够产生H2O2，H2O2作为一种重要的抗菌化合物，能激活动物大肠内的过氧化物酶－硫氰酸盐反应系统，在此系统中，过氧化物酶与H2O2结合，然后将硫氰酸盐氧化成氧化性中间产物，抑制致病菌的生长。乳酸杆菌产生的H2O2能够抑制淋球菌的生长。Pridmore等［5］发现约氏乳酸杆菌NCC533(L.johnsonii NCC533)分泌的H2O2对体外抑制沙门氏菌发挥重要作用。Voltan等［6］发现H2O2能作为一种信号转导分子，诱导肠道上皮过氧化氢酶体增殖，引发受体γ(PPAR－γ)的激活，从而直接调节上皮细胞对肠道炎症的免疫应答。

1.3 细菌素

细菌素是一类选择性地作用于细菌靶细胞的抗菌物质，它们大多属于多肽类且为水溶性。乳酸杆菌可产生细菌素莴苣苦素B(Lactacin B)、乳酸菌素27(Lactocin 27)和Helveticin J等。大多数乳酸杆菌产生的细菌素体积小，为具有高等电点的热稳定性蛋白质，称之为Ⅱ类细菌素，可通过诱导致病菌细胞膜的通透化，使得致病菌的胞内物质外漏，进而发挥杀菌作用［7］。嗜酸性乳酸杆菌产生的细菌素还可抑制大肠杆菌DNA的合成。Corr等［8］的研究显示，唾液乳酸杆菌 UCC118能产生大量的Ⅱ类细菌素Abp118，在体内具有有效的抗菌功能。

2 乳酸杆菌对病原菌的竞争与排斥作用

乳酸杆菌可与病原菌竞争利用肠道食糜内的营养成分，竞争肠道上皮与黏膜内共同的黏附位点，通过占据黏附位点抑制病原菌的黏附，竞争性排斥病原菌。

2.1 竞争营养物质

乳酸杆菌通过对营养物质的竞争来抑制有害菌。营养物质竞争发生在小肠上皮细胞，添加乳酸杆菌等益生菌后，益生菌群占优势，可优先吸收利用小肠食糜内的营养物质进行生存和繁殖，抑制有害菌在消化道的增殖。Sonnenburg等［9］研究发现，干酪乳酸杆菌 DN－114001(L.casei DN－114001)植入宿主后，该菌对木聚糖和阿拉伯糖等多糖的利用加强，从而抑制多形拟杆菌(Thetaiotaomicron)的生长。Nikoskeilainen 等［10］发现，鼠李糖乳酸杆菌ATCC 53103(L.rhamnosus ATCC 53103)、鼠李糖乳酸杆菌 LC 705(L.rhamnosus LC 705)、干酪乳酸杆菌(L.casei Shirota)、保加利亚乳酸杆菌(L.bulgaria)、约氏乳酸杆菌La1(L.johnsonii La1)或双歧乳杆菌Bb12(Bifldobacterium lactis Bb12)可抑制共培养的鱼致病性杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的生长，但在共培养液体中并未检测到乳酸杆菌释放的抗菌效应物质，间接说明这些乳酸杆菌是通过营养竞争作用来抑制该致病菌的生长。目前尚不清楚乳酸杆菌与肠道致病菌对哪些营养因素存在着竞争，有待进一步深入研究。

2.2 竞争黏附位点

有益菌在肠道内能与黏膜上皮结合紧密，形成一层生物膜，排斥部分致病菌。无论是乳酸杆菌还是致病菌在体内发挥作用的前提是黏附，乳酸杆菌在肠道内的定植和黏附是乳酸杆菌发挥主要作用的基础。黏附是特异性的，乳酸杆菌通过表面黏附素与宿主受体特异性结合，表面黏附素主要有细菌表面蛋白、细胞壁毛缘、脂磷壁酸(LTA)和多糖等。然而，有些病原菌能识别乳酸杆菌黏附的相同宿主受体，二者对受体形成竞争黏附。另一方面，乳酸杆菌能够产生蛋白质促凝聚因子来促进病原体凝聚，从而阻碍病原体黏附肠道上皮［11］。Collado 等［12］认为，乳酸杆菌对肠道上皮细胞有很强的亲和性，能优先与肠道受体结合，故对病原菌如大肠杆菌和沙门氏菌的定植具有竞争性阻碍作用。有研究报道，卷曲乳酸杆菌ZJ001的表层提取物能竞争性地排斥出血性大肠杆菌(EHEC)和肠道鼠伤寒性沙门氏菌，从而有效保护动物肠道［13］。

3 乳酸杆菌对肠道上皮的保护作用及机制

肠道上皮的功能会受到感染、食物过敏等各种不利因素的影响，而乳酸杆菌等益生素可通过诱导黏液素分泌、阻止上皮细胞凋亡等机制来增强上皮细胞的屏障功能。研究发现，嗜酸性乳酸杆菌ATCC4356能通过激活促细胞分裂蛋白激酶(MAPK)，调节肠上皮细胞的抗炎症和细胞凋亡效应，有效地保护肠道上皮［14－15］。鼠李糖乳酸杆菌GG能抑制肿瘤坏死因子α(TNF－α)，激活抗细胞凋亡 MAPK p38，发挥其肠道保护功能［16］。该类效应有些是需要乳酸杆菌与宿主肠道直接接触的，有些不需要直接接触，但均需要相应的效应因子的调节。

3.1 细胞表面因子

乳酸杆菌的表面因子如细胞表面蛋白、LTA、细胞外多糖等是重要的效应调节因子，在乳酸杆菌的定植过程中发挥着很大作用。约氏乳酸杆菌La1和嗜酸性乳酸杆菌的LTA能抑制HT－29上皮细胞中白细胞介素的释放［17］。

3.2 分泌蛋白质

乳酸杆菌的有些效应分子不需要经过直接的细胞接触而发挥对肠道的促健康作用，如分泌蛋白质。最近研究发现，鼠李糖乳酸杆菌GG分泌的2种蛋白质p40和p75能通过特异的信号通路改善肠道上皮的稳定性，促进肠上皮细胞的生长，抑制TNF－α诱导的上皮细胞的凋亡，从而对肠道上皮起重要的保护作用［14，16］。

3.3 可溶性肽

乳酸杆菌产生的可溶性肽在调节肠道上皮的屏障功能上起着重要的作用。例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的群体信息感应(QS)分子集落刺激因子(CSF)能够诱导产生保护性热应激蛋白来防止肠道上皮功能的紊乱［18］。

4 乳酸杆菌免疫调节作用及机制

乳酸杆菌可引导非特异性免疫调节作用，刺激肠道免疫细胞，加强肠道自身的免疫系统功能，特别是增强巨噬细胞的功能，并通过刺激特异性免疫应答，增加血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)水平，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞成熟，从而增强细胞免疫，提高肠道免疫力和抗病力，抵抗肠道肿瘤、炎症等疾病。Schiffrin等［19］发现，约氏乳酸杆菌和双歧乳酸杆菌在体外能增强吞噬细胞对大肠杆菌的吞噬作用。乳酸杆菌的免疫促健康功能离不开其表面的配体和肠道上的受体，外源乳酸杆菌进入肠道后，只有其表面物质与肠上皮细胞表面的特异受体相结合，并通过信息转导，才能激活机体的免疫应答。

4.1 乳酸杆菌表面的配体

近年来研究证实，乳酸杆菌表面成分在增强宿主免疫中起着重要的作用，如LTA、细胞壁肽聚糖(PG)、细胞表面蛋白(S－protein)以及一些未知的细胞表面提取物。乳酸杆菌表面物质作为配体被Toll样受体(TLR)等受体识别后激活免疫信号通路(图1)，产生细胞因子和趋化因子［20］。

图1 外来抗原微生物的不同细胞表面配体与TLR家族的关系示意图Fig.1 Schematic diagram of the relationship between cell surface ligand of foreign antigen microorganism and TLRs［20］

4.1.1 细胞表面蛋白

乳酸杆菌表面覆盖一层表面蛋白，分子量25～71 ku，均为碱性蛋白，等电点在9.35～10.40之间。汪海峰等［21］全面综述了S层蛋白、引物酶sortase依赖蛋白、黏膜结合蛋白和胞外间质黏附的调节性表面蛋白等乳酸杆菌表面蛋白结构特征及其在肠道黏附中的作用与机制。有关乳酸杆菌表面蛋白在黏附肠道上皮中作用的研究较多，而对于表面蛋白在免疫调节中的作用还知之甚少。Bergonzelli等［22］发现，约氏乳酸杆菌(L.johnsonii NCC533)细胞表面的热应激蛋白GroEL能够促进该菌对HT－29细胞和肠黏膜的黏附，并能促进肠道上皮和巨噬细胞产生细胞因子白介素8(IL－8)。Grannato等［23］发现，L.johnsonii NCC533 细胞表面延长因子EF－Tu蛋白在可溶性CD14的刺激下能够诱导促炎症因子IL－8的分泌。敲除嗜酸乳杆菌NCFM(L.acidophilus NCFM)的slpA基因能有效抑制细菌与树突状细胞上表达的C型凝聚素受体(CLR)(DC－SIGN，属于Ⅱ型跨膜蛋白)的黏附，显示表面蛋白slpA是C型凝聚素受体DC－SIGN的配体，研究同时发现，slpA基因能促进白细胞介素 1β(IL－1β)、白细胞介素 6(IL－6)、白细胞介素10(IL－10)、白细胞介素 12(IL－12)p70 和 TNF－α的生成［24］。

4.1.2 LTA

LTA普遍存在于革兰氏阳性细菌中，并大量存在于乳酸杆菌的细胞表面，不仅能够介导细菌的黏附，还作为CD细胞表面受体的配体，与受体结合后刺激机体产生免疫因子，如TNF－α和白细胞介素1(IL－1)。研究发现，LTA能够通过蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇－3激酶(PI3K)、MAPK家族c－Jun氨基末端激酶(JNK)和p38通路来激活单核细胞和巨噬细胞产生炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF) 和 IL－1［25］。Matsuguchi等［26］发现，干酪乳酸杆菌YIT9029(L.casei YIT9029)和发酵乳酸杆菌YIT0159的LTA分子主要与TLR2结合，并能激活NF－κB的信号，诱导小鼠巨噬细胞分泌TNF－α。

4.1.3 PG

肽聚糖是乳酸杆菌细胞壁的主要成分，厚约20～80 nm，主要是通过TLR的介导来发挥其在先天性免疫中的作用。研究表明，在体外试验中乳酸杆菌细胞壁肽聚糖能刺激巨噬细胞的成熟，并能诱导细胞因子的产生，产生免疫学效应。研究发现，来自约氏乳酸杆菌、植物乳酸杆菌和金黄色葡萄球菌PG通过与TLR2受体结合，抑制了干酪乳酸杆菌诱导细胞因子 IL－12生成作用［27］，间接证明肽聚糖通过TLR2受体发挥免疫调节作用。目前研究最多的PG片段是胞壁酰二肽(MDP)和N－乙酰胞壁酸脂(DAP)，主要识别Nod样受体(NLR)中的核酸结合寡聚化结构域1(NOD1)和核酸结合寡聚化结构域2(NOD2)。

4.2 免疫调节相关受体

4.2.1 CLR

CLR位于树状突细胞、巨噬细胞等表面，主要是通过识别机体自身或非自身抗原的碳水化合物的结构来识别抗原，并进行处理和呈递信息。CLR内含有碳水化合物识别结构域(CRD)，但是该受体并不能诱导DC细胞的成熟［24，28］。典型的CLR含1个或多个糖基识别域，其蛋白表面突起的环上存在2个CLR功能所必需的钙离子(Ca2+)结合位点。CLR受体众多，目前已发现约有60几种，主要为分泌型和跨膜型2种类型。分泌型CLR的主要代表是胶原凝集素家族，主要为血清甘露糖结合蛋白(MBP)、肺表面活性蛋白SP－A和SP－D，MBP主要是识别革兰氏阴性菌表面的糖类物质，如D－甘露糖、N－乙酰氨基葡萄糖和L－海藻糖等［29］。跨膜型CLR根据其 N端朝向不同分为Ⅰ型和Ⅱ型2种，除了甘露糖受体(MR)和树状突细胞受体DEC－205分别含有8个和10个 CRD，属于Ⅰ型外，DC表达的大多数CLR属于Ⅱ型跨膜蛋白，所有Ⅱ型CLR都只含一个CRD，典型代表有选择素家族、MR家族和DCSIGN家族等。

4.2.2 TLR

TLR是先天性免疫中主要的识别受体，能有效地区分自身与非自身抗原，并能有效协调下游信号产生的各种炎症因子之间的作用。已经发现的TLR家族有12种，均为跨膜蛋白，TLR具有1个富含亮氨酸重复序列的细胞外结构域和1个包含高度保守Toll/IL－1受体结构的细胞质结构域，2大结构域参与配体的识别，识别外来抗原，进而进行信号转导［30－31］，目前研究的 主要 为 TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。研究表明，不同的TLR识别不同的配体，TLR1与TLR2主要识别细菌脂蛋白、肽聚糖以及脂多糖(LPS)，TLR4识别LPS等，TLR5识别鞭毛蛋白，TLR9识别CpGDNA(微生物DNA中广泛存在的一种基因)等［20］(图1)。有的受体并不是简单地单独与配体识别，有时候还需与其他配体进行物理结合形成二聚体，才能识别配体，诱导信号的产生。通过抑制 TLR2或者TLR6能够明显抑制酵母聚糖和肽聚糖对巨噬细胞的影响，证明酵母聚糖和肽聚糖是通过TLR2－TLR6二聚体进行识别的［32］。另外，有的受体与配体识别需要第三方物质(如一些蛋白质)的参与，如TLR4与LPS配体识别时，需要LPS－结合蛋白MD－2的参与，该蛋白首先与LPS结合，后将LPS转移到CD14细胞上与TLR4结合，完成抗原的识别，并激活下游信号［33］。

4.2.3 NLR

NLR是胞质受体，配体需进入细胞质才能与之相结合，激活下游信号通路，发挥免疫调节作用，NLR受体中心区域有NACHT结构域、CⅡTA结构域(MHC classⅡ transcription activator)和蛋白与蛋白互作结构域，该结构域主要包括3个部分:一个是半胱氨酸天冬氨酸激酶募集结构域(CARD)或具有免疫作用的蛋白结构域(PYD)，另两个为核酸结合寡聚化结构域(NOD)和富含亮氨酸的重复结构域［34］。典型的 NLR主要有CⅡTA、NALP1、白介素转化酶激活因子(IPAF)、神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)、NOD1、NOD2等。研究最详细的是NOD1和NOD2，它们主要识别细菌表面 PG成分，如 MDP和 DAP，他们也是NLR的2个常见配体。NOD1在肠道上皮表达，而NOD2只有单核细胞和巨噬细胞及肠道潘氏细胞能表达，这些受体与细胞表面配体结合后激活NF－κB和 MAPK 通路［35］。目前 NLR 与肽聚糖序列结合的模式还不清楚，尚未证实NLR与PG序列是直接结合还是间接结合。有关细胞壁表面PG成分是如何进入细胞质内与NLR结合的，仍有待进一步研究。

4.3 免疫调节的受体识别及信号传导

肠黏膜除了分泌黏液形成机体第一道免疫防线外，还能通过分布于肠黏膜系统的网状树突细胞和其他抗原呈递细胞对外来真菌、病毒、细菌等抗原进行吞噬处理和递呈作用，通过TLR和NLR将信息传递给免疫细胞，从而激活机体的免疫系统，产生炎症因子和细胞趋化因子，通过发炎和体温升高来抵制外来抗原。参与TLR信号转导的主要有细胞质调节分子髓系分化蛋白88(MyD88)、与IL－1受体相关的蛋白激酶(IRAK)、与TNF受体相关的调节蛋白因子6(TRAF6)和Toll相关蛋白(Tollip)。当乳酸杆菌进入肠道后与TLR相接触时，MyD88被IRAK召至TLR，然后IRAK进行磷酸化，进而通过与TRAF6互作来传递下游信号［20，36］，进而诱导 NF－κB 和 MAPK 信号传导通路，产生促炎症细胞因子和趋化因子，分泌抗菌肽［36］(图2)。已经发现的促炎症细胞因子主要有IL－1β、IL－6、IL－8、IL－12、INF－γ 和 TNF－α 等。

图2 乳酸杆菌肠道免疫调节过程示意图Fig.2 Schematic diagram of the immunological regulation process of lactobacilli in intestinal tract［36］

NLR受体的识别及信号传导较为复杂，NLR受体众多，信号通路也各不相同，但是典型的主要为以下2种，一个是典型的 MAPK和 NF－κB通路，另一个就是半胱氨酸蛋白酶(Caspase－1)介导的免疫调节作用。前者通过NOD1与NOD2免疫调节通路进行调节，即NOD1与NOD2首先识别PG成分(如 MDP和 DAP)，召集受体互作蛋白－2(RIP2，一种丝氨酸 －苏氨酸激酶)，并与IκB 激酶(IKK)和 NF－κB 抑制因子(IκB)互作，激活MAPK和NF－κB通路，然后产生免疫细胞因子如 IL－6、TNF－γ、IL－12 和 IL－8［37－38］，该过程需要转化生长因子－β激活激酶1(TAKI)和鸟苷三磷酸酶激活蛋白 Centaurinβ1(GTPase－activating protein Centaurinβ1)等的参与［39］，但目前这些蛋白的具体作用机制还尚未明了。另外一些NLR，如Nalp1、Nalp3、Ipaf和Naip主要通过激活 Capase－1来诱导细胞因子的产生，其中需要NLR调节蛋白ASC的参与，诱导产生IL－1家族和IL－18，进而发挥免疫效应［40］。可见，NF－κB、MAPK 通路和 Caspase－1介导的通路存在明显区别，NF－κB、MAPK通路是通过激活信号通路后刺激相关细胞因子的基因表达，即通过控制基因表达实现调控作用;而Caspase－1通路主要是控制细胞调亡和相关细胞因子的成熟而实现调控。

5 小结

乳酸杆菌通过分泌代谢产物、竞争排斥、免疫调节等多种方式来发挥益生作用。目前的研究主要侧重于乳酸杆菌的免疫调节和竞争黏附作用效应，其作用的前提是乳酸杆菌表面成分与肠道上皮细胞的受体互作，但乳酸杆菌表面成分与受体之间具体识别方式仍然不十分明了，有关表面成分在肠道识别后的信号启动与传导机制仍有待进一步深入研究。作者目前正在开展乳酸杆菌对猪肠道上皮细胞免疫调节效应及NF－κB信号传导通路解析研究，以期对乳酸杆菌肠道免疫调节作用相关机制进行阐述。

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