结核分枝杆菌Rpf－DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

邢爱英 刘忠泉 刘洋 贾红彦 李自慧 郑晓静 曹廷明 杜凤娇 杜博平 古淑香 张宗德

近几年来，全球TB患者有不断增加的趋势，我国TB发病率居世界第二。耐药结核病、流动人口罹患TB、Mtb和HIV的双重感染者的增加以及BCG对成年人保护作用的不佳（0%～70%）［1］使得我国结核病的预防控制工作进一步加剧。结核疫苗的研制一直是结核预防控制工作方面的一大主要措施。笔者在克隆、表达复苏因子（resuscitation－promoting factor，Rpf）蛋白质的基础上，应用5个复苏因子蛋白质疫苗免疫BALB／c小鼠后，用Mtb标准株H37Rv感染BALB／c小鼠，发现复苏因子D、E有很高的免疫原性［2－3］。因此，笔者构建了 Mtb Rpf D、Rpf E－DNA疫苗，探讨 Rpf D及 Rpf E－DNA疫苗对感染Mtb的BALB／c小鼠的免疫特性。

材料和方法

一、材料

SPF级BALB／c型小鼠（4周龄）购至自北京维通利华实验动物技术有限公司；H37Rv标准株为本室保存；Glas－col吸入暴露系统为 Glas－col公司产品；佐剂阳离子聚合物购自厦门太阳马生物工程有限公司；IFN－γ、IL－2、IL－12 检测试剂盒购自美国R＆D公司；淋巴细胞增殖试剂（Cell Counting Kit CCK－8）购自美国罗氏公司；非放射性细胞毒性检测试剂盒购自美国Promega公司；兔抗小鼠抗血清抗体购自Sigma公司；His Bind Purification Kit（融合标签蛋白纯化试剂盒）购自美国Novagen公司。

二、方法

1．Rpf D、Rpf E－DNA质粒疫苗的构建和表达：具体方法参考文献［4］。

2．转染质粒制备：按照梭华Sofast基因转染试剂盒操作说明书制备。

3．免疫动物：180只SPF级4周龄BALB／c雌性小鼠，平均分为6组。即空质粒组、Rpf D质粒组、Rpf E质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组。空质粒组、Rpf D质粒组、Rpf E质粒组和生理盐水组分别背部皮下接种空质粒转染质粒、Rpf D－DNA转染质粒、Rpf E－DNA转染质粒、生理盐水各200μl；而空白对照组不免疫。BCG组在各组第3次免疫时进行BCG免疫（每只免疫BCG 105CFU），3周后第2次免疫；再过3周第3次免疫。

4．感染动物：第3次免疫后的第4周，用含吐温80的7H9液体培养基（自配）复苏培养H37Rv并以PBS稀释至5×107CFU，分别取10ml雾化感染各组小鼠。

5．淋巴细胞的制备：在感染后第8周各组采用直接抽选法随机抽取24只小鼠，眼球取血1．0ml和取脾脏及全肺。血液分离血清备用，脾脏用分子筛分离淋巴细胞，淋巴细胞分层液纯化淋巴细胞，加入防冻液液氮中保存。全肺取少许组织进行病理检查，余下的组织10倍等比稀释，各取100μl涂于7H11平板，置于37℃恒温培养箱培养，进行菌负荷实验。每组余6只观察生存状态。

6．血清的免疫学试验：血清按ELISA方法分别检测血清中抗IgG抗体和IFN－γ［5］。

7．淋巴细胞增殖试验（lymphocyte proliferation test）：复苏淋巴细胞，调整细胞浓度为1×105／ml，取48孔板，加300μl含两性霉素B（终浓度为1mg／L）的1640培养基和100μl淋巴细胞，并设不加细胞的空白对照孔，细胞培养箱培养24h，加入10μl（800μg／ml）复苏因子D或E，并设不加复苏因子蛋白质的阴性对照和加入1μl（1000μg／ml）刀豆球蛋白A（Concanavalin A，Con A）作为阳性对照。3d后取300μl上清ELISA方法检测IFN－γ和IL－12，IL－2，细胞培养板加入10μl CCK－8，细胞培养箱培养4h时，450nm测A值。淋巴细胞增殖率（SI）＝刺激孔A值／对照孔A值×100%。

8．CTL杀伤效应实验（CTL killing activity）：复苏小鼠脾淋巴细胞并调整细胞浓度为1×105／ml，采用美国Promega公司生产的非放射性细胞毒性检测试剂盒（LDH法）检测。

9．组织病理分析：肺组织作病理切片，进行HE染色［6］。

10．小鼠肺组织CFU计数，上述7H11平板培养第20和30天分别计数细菌菌落。

11．统计学处理：采用SPSS 11．5软件分别对疫苗免疫组（RpfD、RpfE）与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组进行F检验。

结 果

1．组织病理形态：空白对照组、空质粒组、生理盐水组：肺颜色灰白，表面有大量粟粒性结核病灶（图1）。RpfD质粒组、Rpf E质粒组、BCG组：肺颜色鲜红，表面光滑，散在少量粟粒性结核病灶（图2）。

2．血清抗体及IFN－γ检测：Rpf D、E质粒组血清抗体与其他各组比较差异有显著统计学意义（P值均＜0．01）；Rpf D、E质粒组IFN－γ与BCG组比较差异有统计学意义（P值均＜0．05）；Rpf D、E质粒组IFN－γ与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义（P值均＜0．01）。Rpf抗体及IFN－γ在RpfD组与RpfE组之间差异均无统计学意义（P值均＜0．05）（表1）。

RpfD质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较，RpfD抗体F值分别为45．6，43．2，45．1，45．7，P值均＜0．01。IFN－γF值分别为10．2，15．6，17．8，17．3，RpfD 质粒组与 BCG 组比较P＜0．05，与其余各组比较P值均＜0．01。RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较，RpfE抗体F值分别为51．5，53．6，51．0，52．2，P值均 ＜0．01。IFN－γF值分别为12．4，17．5，21．1，20．7，RpfE质粒组与BCG组比较P＜0．05，与其余各组比较P值均＜0．01。

3．淋巴细胞增殖实验及杀伤实验：Rpf D、E质粒组CCK－8与空质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义（P值均＜0．05）；Rpf D、E质粒组杀伤实验（LDH）与空质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义（P值均＜0．05）；CCK－8及LDH 在Rpf D组与Rpf E组之间差异均无统计学意义（P＞0．05）（表2）。

RpfD质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较，CCK－8F值分别为9．5，10．1，10．0，9．0，P值均＜0．05。LDHF值分别为8．8，14．5，13．7，11．9，P值均＜0．05。RpfE 质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较，CCK－8F值分别为11．2，12．9，11．7，10．3，P值均＜0．05。LDHF值分别为8．1，12．5，11．6，11．1，P值均＜0．05。

RpfD质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较，IL－12F值分别为5．0，1．9，2．3，2．7，P值均＞0．05。IL－2F值分别为12．5，14．6，13．5，13．9，P值均＜0．05。IFN－γF值分别为7．8，12．6，8．7，8．3，P值均＜0．05。RpfE 质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较，IL－12F值分别为 3．3，1．7，1．5，1．3，P值均＞0．05。IL－2F值分别为12．0，13．6，13．1，13．2，P值均 ＜0．05。IFN－γF值分别为 11．3，16．4，14．7，14．2，P值均＜0．05。

5．肺病理检测：Rpf D质粒组、Rpf E质粒组无明显炎症灶（图3，4）；BCG组有少量小面积炎症灶（图5）；空质粒组、生理盐水组、空白对照组有大量且面积大的炎症灶（图6～8）。

表1 小鼠血清 Rpf D、Rpf E抗体（A 值）和IFN－γ（pg／ml）检测结果（±s）

表1 小鼠血清 Rpf D、Rpf E抗体（A 值）和IFN－γ（pg／ml）检测结果（±s）

．04 0．03±0．01 IFN－γ（pg／ml） 43．9±24．8 45．9±21．0 21．0±11．0 7．9±4．9 4．7±2空质粒组 生理盐水组 空白对照组抭体（A值） 0．32±0．1 0．39±0．1 0．02±0．01 0．01±0．0 0．09±0 RpfD质粒组 RpfE质粒组 BCG组．12 5．8±4．7

表2 细胞免疫原性检测结果［SI／CTL，（±s）%］

表2 细胞免疫原性检测结果［SI／CTL，（±s）%］

SI／CTL（%） Rpf D质粒组 Rpf E质粒组 BCG．0±8．4 116．0±2．2 LDH（CTL） 32．0±3．2 30．0±4．2 16．0±5．9 3．3±1．5 6．7±0．5 7质粒组 空质粒组 生理盐水组 空白对照组CCK－8（SI） 176．0±4．2 183．0±4．3 101．0±1．1 100．0±6．8 104．3±3．5

表3 淋巴细胞增殖上清IL－12、IL－2和IFN－γ检测结果［（±s）pg／ml］

表3 淋巴细胞增殖上清IL－12、IL－2和IFN－γ检测结果［（±s）pg／ml］

．2 20．0±17．2 25．0±15．3 IL－2 9．5±2．4 9．2±1．2 2．4±2．1 1．2±0．3 1．8±1．0 1．5±0．7 IFN－γ 22．2±5．7 28．7±14．4 16．1±10．1 9．8±1．6 13．2±2空质粒组 生理盐水组 空白对照组IL－12 21．0±15．2 23．0±14．2 27．0±17．8 22．5±20 Rpf D质粒组 Rpf E质粒组 BCG组．1 15．7±2．9

图3 Rpf D质粒组HE×10；无明显炎症灶，无渗出，肺组织完整。图4 Rpf E质粒组HE×10；无明显炎症灶，无渗出，肺组织完整。图5 BCG组HE×10；少量、分散、小面积炎症灶，渗出少，肺组织完整。图6 空质粒组HE×10；大量、大面积炎症灶，切片显微镜下有大量渗出物，2／3肺组织细胞破坏。图7 生理盐水组HE×10；大量、大面积炎症灶，切片显微镜下有大量渗出物，2／3肺组织细胞破坏。图8 空白对照组 HE×10；大量、大面积炎症灶，切片显微镜下有大量渗出物，2／3肺组织细胞破坏

6．肺菌负荷量（CFU）计数结果：Rpf D质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组和空白对照组比较差异有显著统计学意义（F值分别为22．3，40．2，35．8，28．7，P值均＜0．01）；Rpf E质粒组与 BCG组、空质粒组、生理盐水组和空白对照组比较差异有显著统计学意义（F值分别为19．5，36．7，32．8，30．0，P值均＜0．01）（图9）。

图9 肺CFU计数直方图（各24只小鼠，CFU为平均数）

7．小鼠生存质量实验：各组的6只小鼠观察结果表明：对照组、生理盐水组、空质粒组在感染Mtb 3个月后出现行动缓慢、精神状态差、毛色无油脂、体质量减轻等症状。RpfD质粒组、RpfE质粒组、BCG组各方面与感染前没有太大变化。

讨 论

估计全球约1／3人口为Mtb潜伏感染者，其中约有5%～10%的人会在一生中的某个时间发展为活动性结核病［7］。新发TB患者主要来源于潜伏Mtb感染者，原因在于休眠 Mtb的再激活和复苏［8－9］。Bigger［10］指出休眠菌是一组休眠的、非复制的、对抗菌药物感觉迟钝的持留菌。因此对于结核病的控制，提高结核疫苗的预防保护效果势在必行，传统结核疫苗BCG的保护效率不佳，对Mtb再感染没有免疫保护作用［11］。Mtb复苏因子是与Mtb复苏有关的因子，一般认为复苏因子蛋白质产生的免疫效应在感知正在复苏的休眠Mtb中起着重要作用，同时复苏因子蛋白质也可能在正在复苏的休眠Mtb的宿主免疫调控中起着重要作用［12］。

笔者选择阳离子聚合物为佐剂与Rpf D、E质粒混匀构建DNA疫苗免疫小鼠3次，用H37Rv雾化感染小鼠，4周后处死小鼠检测感染小鼠免疫学指标及病理检测、细菌负荷计数等办法研究复苏因子疫苗的免疫保护作用。本研究结果表明，从肺外观察空质粒组、生理盐水组、空白对照组小鼠肺有大量的粟粒状结核病灶，且肺外观颜色灰白。而BCG和复苏因子D、E质粒组小鼠肺粟粒状结核病灶明显减少，特别是Rpf D、E两组，且颜色较为红润，表面光滑。小鼠肺组织CFU计数也表明空质粒组、生理盐水组、空白对照组、BCG组肺菌负荷量在105级，而Rpf D、E质粒组肺菌负荷量只在104级，差异有显著统计学意义（P＜0．01），表明 Rpf D、E－DNA疫苗在抑制感染小鼠Mtb生长方面有明显的作用，BCG组有一定的抑菌作用。病理检测发现复苏因子免疫组和BCG免疫组为组织轻度炎症，而空质粒组、生理盐水组、对照组为组织中或重度炎症。Yeremeev等［1］报道复苏因子蛋白质疫苗在接种大剂量的毒力Mtb H37Rv小鼠中表现出明显的保护作用，在小鼠肺脏和脾脏中Mtb的繁殖和生存时间都受到抑制，与本研究的结果一致。

感染免疫小鼠血清复苏因子抗体及IFN－γ的检测表明：Rpf D、E质粒组抗体水平明显高于BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组（P＜0．001）。Rpf D、E质粒组IFN－γ表达水平与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义（P＜0．001），与BCG疫苗组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。表明Rpf D、E质粒在感染小鼠体内启动了感染宿主的体液免疫。笔者在Rpf E－DNA疫苗对BALB／c小鼠免疫效应研究的试验中也得到了相应的结果。Yeremeev等［1］报道Rpf蛋白质疫苗在小鼠试验中有很高的免疫反应，除Rpf C外，均能诱导产生抗体IgG1和IgG2α、IFN－γ、IL－10、IL－12、促进 T细胞增殖，而不产生IL－4、IL－5。体液免疫和T细胞免疫显现出高度的交叉反应，与本研究的结果一致。

Romano等［13］的研究表明：对于 BABL／c小鼠，Rpf D、Rpf B能诱导结核感染小鼠脾淋巴细胞产生高水平的IFN－γ和IL－2；Commandeur［12］认为复苏因子A和D能诱导有Mtb暴露的健康人群产生高水平的细胞因子，而对结核患者Rpf D能诱导产生高水平的细胞因子，Rpf A诱导不产生或产生少量的细胞因子。Mtb感染疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖实验（CCK－8）结果显示：Rpf D、E质粒组也有较高的淋巴细胞增殖率，与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。通过上清细胞因子水平检测表明：IL－2、IFN－γ水平，RpfD、E质粒组与BCG免疫比较差异有统计学意义（P＜0．05），与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义（P＜0．001），而IL－12的表达差异没有统计学意义，并且都在低水平。本研究结果表明Rpf D、E疫苗能在感染小鼠体内产生很好的T细胞免疫，与Romano等［13］和 Commandeur［12］报道中的 Rpf B、Rpf D 疫苗对机体能产生很好的免疫保护作用一致。而Rpf D－DNA和Rpf E－DNA 疫苗结果各项指标间差异无统计学意义，表明 Rpf D－DNA 和 Rpf E－DNA疫苗对感染小鼠有同等的免疫效果。

本研究结果表明，复苏因子疫苗可增强Mtb感染小鼠的细胞免疫功能，并且能有效地减少肺组织菌负荷量，提高生存质量。笔者拟进一步建立小鼠潜伏感染模型并观察预防结核病“复燃”的效果，以期从另一角度研究新型的结核病预防性疫苗。

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