饲粮中三聚氰胺对乳成分的影响及其在牛奶中的残留规律

赵小伟 哈斯额尔敦 王加启，* 卜登攀 魏宏阳 周凌云 王 俊 许晓敏

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所反刍动物营养研究室，北京 100193;3.农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京)，北京 100193)

三聚氰胺(melamine)，学名 1，3，5 － 三嗪 －2，4，6 －三胺，化学式 C3H6N6，酸度系数(pKa)为5.0，相对分子质量为 126.12，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物(图1)，是尿素后加工产品，主要用作生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料［1］。三聚氰胺含氮量高达66%，早期的毒性研究认为，三聚氰胺对哺乳动物表现为低毒［2］。有研究在肉牛和绵羊的饲粮中添加三聚氰胺作为非蛋白氮，试图提高饲料效价，结果表明，尽管三聚氰胺在反刍动物瘤胃内可部分水解(＜20%)，但其总氮利用效率并不理想［3－4］。而三聚氰胺在奶牛体内的代谢规律以及是否有向牛奶迁移的现象尚未得到充分研究考证。奶牛泌乳的生理特点决定了血乳屏障能够快速过滤血液、摄取泌乳所需的组分，因此认为乳成分极易受到饲粮因素的调控［5］。Cruywagen等［6］报道，饲喂受三聚氰胺污染(相当于饲喂17.1 g/d三聚氰胺)的玉米胚芽饼会使三聚氰胺由饲料中迅速迁移至牛奶中，迁移效率为1.7% ～2.1%。由此可见，饲粮中的三聚氰胺很容易通过血乳屏障进入牛奶。2007年美国发生的宠物饲料三聚氰胺事件发现，生产宠物饲料的副产品(制粒后的碎屑)大量用于猪禽饲料加工中，随即美国食品药品管理局(FDA)对食用污染饲料的猪禽可食组织进行了三聚氰胺残留检测，但检出结果比预计危害人体健康的上限值低 250 倍之多［2，7－8］。2008年中国在婴幼儿奶粉中检测出高剂量三聚氰胺，此后更是引起了各国研究人员对三聚氰胺毒性研究的重视。同时，奶牛饲粮中不同添加剂量的三聚氰胺在牛奶中三聚氰胺残留方面的研究还未见报道。因此，本试验旨在通过在泌乳奶牛饲粮中添加不同剂量的三聚氰胺，研究饲料中三聚氰胺向牛奶的转化效率和消失规律，为研究三聚氰胺的毒性作用提供依据。

图1 三聚氰胺化学结构Fig.1 Chemical structure of melamine

1 材料与方法

1.1 试验动物与设计

动物试验在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所反刍动物营养研究室实验牛场进行。试验选用9头泌乳中期［泌乳日龄(DIM)为(160±21)d］、健康的中国荷斯坦奶牛。日饲喂2次(07:00和19:00)，自由饮水;日挤奶2次(06:00和18:00)。参照 NY/T 34—2004《奶牛饲养标准》［9］，以玉米、豆粕、麦麸、棉籽粕、羊草、苜蓿及玉米青贮为主要原料配制基础饲粮，试验饲粮为在基础饲粮中添加 0.1%(MEL1 组)、0.5%(MEL2组)和1.0%(MEL3组)三聚氰胺的饲粮(干物质基础;三聚氰胺含量为99.5%，购自河南中原大化集团有限责任公司)，饲粮组成及营养水平见表1。试验期每日称量并记录每头奶牛饲喂量和剩料量，用于计算干物质采食量(DMI)。

试验采用完全随机区组设计，以产奶量为区组依据将奶牛分为3组，每组3头。对照组奶牛和试验组奶牛分别饲喂基础饲粮和试验饲粮。试验预试期7d，期间只饲喂基础饲粮;正试期28d，包括持续饲喂含三聚氰胺的饲粮14d，停喂三聚氰胺后继续观测14d。在饲喂期开始前和第1、3、6、10、14 天以及停喂后的第 1、3、6、10、14 天分别记录试验奶牛日排尿次数和尿量，同时试验期间每日观察奶牛采食、反刍、排粪和躺卧等行为，出现异常时进行记录并依据实际情况对症诊治。

1.2 样品采集

1.2.1 饲料样品采集

试验开始前分别采集饲料样品，其中混合精料500 g、粗料500 g，进行粉碎，过40目筛，用于测定水分、粗灰分、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)、磷(P)和三聚氰胺含量。

1.2.2 牛奶样品采集

每日记录产奶量，牛奶样品在饲喂三聚氰胺的第12、13、14天连续采集，并在饲喂期开始前和第 1、3、6、10、14 天以及停喂后第 1、3、6、10、14 天采集。样品采集参照ISO 2008［10］的方法进行，采集的牛奶样品按照早晚实际产奶量比例(约1.00∶1.12)制备混合样本。样本分为 2 份，一份加入防腐剂(0.02%溴硝丙二醇，Sigma公司，美国)，4℃保存，用于测定乳成分;另一份－20℃保存，备测三聚氰胺含量。

1.3 样品检测

饲料样品和牛奶样品分别在“农业部反刍动物饲料安全评价中心”和“农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京)”进行测定。

1.3.1 饲料养分测定

饲料中水分(GB/T 6435—86)、粗灰分(GB/T 6438—92)、CP(GB/T 6432—94)、EE(GB/T 6433—94)、Ca(GB/T 6436—2002)、P(GB/T 6437—2002)含量按照国家标准方法进行测定［11］。NDF和ADF含量采用Van Soest分析方法测定，分析过程中添加了淀粉酶和无水亚硫酸钠［12］。

1.3.2 饲料三聚氰胺含量测定

按照中国农业部公布的三聚氰胺检测方法(NY/T 1372—2007)［13］，采用 Agilent 6890 －5975气相色谱－质谱联用仪(GC-MS，Agilent公司，美国)进行测定。称取5.0 g样本至离心管中，加1%的三氯乙酸溶液50 mL，加入2 mL 22 g/L乙酸铅溶液充分混匀，超声提取20 min，静止2 min，取上层提取液约30 mL转入离心管，在10 000 r/min离心5 min。准确移取10 mL过混合型阳离子固相萃取柱，后用3 mL 15%氨水甲醇溶液洗脱，50℃水浴条件下氮气吹干，准确加入1.0 mL 20% 甲醇水溶液，涡旋混合 1 min，过0.45 μm微孔滤膜，上机测定。

色谱条件:5%苯基二甲聚硅氧烷石英毛细管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，载气为 氦 气(He)，流速1.3 mL/min，不分流进样，进样体积为1 μL，进样温度250℃，升温程序为起始75℃，持续1.0 min，以 30℃/min升温至 300℃，保持2 min，传输线温度为280℃。

表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels ofdiets(DM basis) %

质谱条件:原子质量范围为40～450 amu，电子轰击电离(electron ionization，EI)，电子能量70 eV，容积延迟5 min，四极杆温度150℃，离子源温度230 ℃，定性离子 m/z为99、171、327、342，定量离子m/z 327。

1.3.3 乳成分测定

乳中乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、总固形物率、尿素含量、游离脂肪酸含量、酸度、冰点和体细胞数(SCC)等用全自动乳成分分析仪(Foss Milk-OScanTM，Foss公司，丹麦)测定。

1.3.4 乳中三聚氰胺含量测定

综合USFDA的三聚氰胺检测方法［14］和中国国家标准GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》［15］，采用Waters 2695高效液相色谱仪配Waters 2996型PAD检测器(HPLC，Waters公司，美国)进行测定。均匀取样2.0 mL至离心管中，加1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈5 mL，混匀，超声提取 30 min，4℃ 条 件 下8 000 r/min离心10 min，上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5.0 mL滤液，加入5 mL 水混匀，转移至固相萃取柱，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL 15%氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50℃水浴条件下氮气吹干，残留物用1.0 mL流动相定容，涡旋混合 1 min，过 0.45 μm 微孔滤膜，供高效液相色谱(HPLC)检测。

色谱条件:C18 分析柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流动相为2.02 g庚烷磺酸钠和2.10 g柠檬酸定容至1 L水中，此溶液和乙腈以90∶10比例混合。柱温为35℃，流速为1.0 mL/min，紫外检测器检测波长为240 nm，进样体积为20 μL。

当牛奶样品中三聚氰胺含量HPLC检测结果低于 2 mg/L 时，采用 GC-MS 方法复测［14－15］。

1.4 数据分析

统计学检验采用SAS 8.2软件MIXED模块进行。模块中考虑试验牛的随机因素，固定因素包括三聚氰胺添加剂量以及添加剂量与饲喂天数交互作用。在分析奶牛DMI、产奶量和乳成分数据时以添加三聚氰胺前的数据作为协变量进行协方差分析，以消除试验牛间个体差异。最小二乘均数进行Tukey多重比较，显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 饲粮中三聚氰胺对奶牛生理行为的影响

饲料养分实测值列于表1，GC-MS测定的基础饲粮三聚氰胺含量低于0.05 mg/kg。

三聚氰胺毒性作用主要体现于对泌尿系统的损伤，从本试验奶牛行为观察结果得知，试验期间各组试验奶牛无排尿异常。日平均排尿次数为7次，排尿量为(13.7±3.9)L/d。各组试验奶牛在采食、饮水、反刍和躺卧等行为方面无明显异常。在试验期饲喂至第12天时MEL2和MEL3组各有1头试验牛有轻微腹泻症状，分别持续了2和4d后自然恢复，其他试验奶牛排粪情况无异常。

2.2 饲粮中添加三聚氰胺对 DMI、产奶量和乳组成的影响

奶牛DMI、产奶量和乳成分列于表2。饲粮添加三聚氰胺显著提高了奶牛总氮摄入量(P＜0.01)，但乳蛋白含量和产量并未得到提升(P＞0.05)，DMI和产奶量不受饲粮三聚氰胺水平的影响(P＞0.05)。乳脂、乳糖和总固形物含量等乳成分随饲粮三聚氰胺添加水平的提高无显著变化(P＞0.05)，但乳中尿素含量随三聚氰胺添加水平的提高而显著上升(P＜0.05)，其中MEL3组显著高于 MEL1组(P＜0.05)，MEL2组高于 MEL1组，但差异不显著(P ＞0.05)。

2.3 泌乳奶牛饲粮三聚氰胺在乳中的沉积规律

由图2可见，随着饲粮三聚氰胺含量的增加，牛奶中三聚氰胺含量和产量呈线性增加(P＜0.05)。三聚氰胺在体内的流通速率较高，不易在组织中沉积，或者不被多数组织所吸收。本试验中停喂三聚氰胺后乳中残留迅速消失(图3)。停喂后的第1天(－1d)乳中三聚氰胺含量与饲喂期(第3～14天)残留水平相当(P＞0.05)，而后迅速下降，至第3天(－3d)时，3个剂量组均仅有微量残留，而持续至第6天后三聚氰胺含量均低于GC-MS检出底限( ＜0.05 mg/L)。

3 讨论

3.1 饲粮中三聚氰胺对奶牛生理行为的影响

以往的毒性试验和消化代谢研究表明，三聚氰胺在哺乳动物体内表现为低毒。Melnick等［16］将大剂量(2 250～4 500 mg/kg)的三聚氰胺饲喂给小鼠后(13周)没有观察到明显的中毒现象，但长期摄入(103周)会造成生殖、泌尿系统的损害，并可进一步诱发膀胱癌。急性毒性试验表明，大鼠口服三聚氰胺最大耐受量为3 161 mg/kg BW［17］。在早期动物营养代谢研究中发现，三聚氰胺作为非蛋白氮(NPN)，在肉牛瘤胃中可少量水解，而大量随尿液排出，相对氮生物效价(与绵籽比较)仅为27%［6］;而在绵羊试验中，三聚氰胺一定程度上能够在瘤胃中作为氮源被利用，但对绵羊肾功能损伤显著［18－21］。Baynes等［22］通过断奶仔猪静脉注射(6.13 mg/kg BW)三聚氰胺试验得知，血液中三聚氰胺可迅速消失，平均半衰期为 4.04 h，清除率为每小时0.11 L/kg，认为三聚氰胺能够被肾脏迅速排出，在其他组织中残留的几率小。本试验在奶牛饲粮干物质中添加0.1% ～1.0%三聚氰胺(给量相当于35～350 mg/kg BW)，持续饲喂14d，从排尿以及采食行为等角度观察无肾脏疾病临床症状。这可能与饲喂天数较短有关，三聚氰胺易由尿液排出，而缓慢微量沉积于肾脏和输尿管中［23］。因此少量或短时采食单一三聚氰胺不易形成泌尿系统结石［24－25］。此外在诸多毒性研究中均无三聚氰胺对动物胃肠道功能毒害作用的报道，而在本试验中奶牛腹泻个例的出现，不能排除是由于三聚氰胺对奶牛胃肠道功能的毒害作用所致，其原因还需进一步研究证实。

表2 饲粮添加三聚氰胺对奶牛生产性能、乳成分和三聚氰胺在体内变化情况的影响Table 2 Effects ofdietary melamine on performance，milk composition and melamine change in body ofdairy cows

3.2 饲粮中添加三聚氰胺对 DMI、产奶量和乳组成的影响

通常情况下，乳中尿素含量可反映牛奶中NPN含量，本试验中奶牛饲粮添加三聚氰胺后乳中尿素含量升高，可能与饲粮中NPN(三聚氰胺)含量升高有直接关联，过量或无效的NPN不能被瘤胃微生物水解利用，而被血液摄取，经肾脏过滤，由尿液排出［26］。而血液尿素含量与乳中尿素含量呈正相关［27－28］，因此可推测奶牛饲粮中的三聚氰胺在瘤胃或后肠道内可部分水解为尿素，随乳腺上皮细胞扩散至牛奶中排放。在停喂后(14d)奶牛DMI、产奶量和乳组成等在各组间无显著差异。

图2 饲粮三聚氰胺含量与牛奶中三聚氰胺含量的线性拟合图Fig.2 Linear fit between melamine content indiet and melamine content in milk

图3 牛奶三聚氰胺含量随饲喂三聚氰胺饲粮以及停喂后随天数的动态变化Fig.3 Dynamic changes of melamine content in milk with withdays of cows feddifferent levels of melamine or after removed the melamine from basaldiet

3.3 泌乳奶牛饲粮三聚氰胺在乳中的沉积规律

早期反刍动物营养研究中三聚氰胺和其类似物作为NPN在饲粮中添加，试图作为氮源，补充瘤胃的氨池，但结果并不理想［6，18－21］。从奶牛泌乳生理特点而言，牛奶中几乎所有的成分均由血液通过血乳屏障供给，加以乳腺泌乳的高效性，乳成分受饲粮因素的调控及其显著［7］。在猪和鱼方面的研究中，三聚氰胺在可食组织中仅能微量残留［24］，而牛奶是奶牛机体分泌的产物，也是排泄的一种途径，由本研究结果可知随着采食三聚氰胺含量的增加，牛奶中三聚氰胺含量和产量线性增加，3个剂量组在乳中的转化效率无显著差异，其平均值为(0.51±0.10)%，说明饲粮三聚氰胺能够迅速而较为稳定地转化至牛奶中。根据国家卫生部公布的液态奶中三聚氰胺限量值(2.5 mg/L)，由本试验得出的线性回归方程推算(图2)，泌乳奶牛饲粮中三聚氰胺污染含量在455 mg/kg(饲粮干物质)或在奶牛泌乳水平(13.60±0.21)kg/d条件下，日采食 8 g三聚氰胺时牛奶中残留量将达到限量值(推算值小于本试验中最小剂量，即外推值)。而在 Cruywagen等［6］的研究中，饲粮添加相当于17.1 g/d的三聚氰胺时，其向牛奶的转化率为1.7% ～2.1%，要高于本试验结果，可能是由于试验奶牛产奶水平的差异所致，进而可说明随奶牛泌乳水平的升高饲粮中三聚氰胺由牛奶排出的比例随之升高，该结论还需进一步研究证实。

4 结论

① 泌乳奶牛饲粮添加三聚氰胺(0.1% ～1.0%)可迅速转化进入牛奶，显著提高牛奶三聚氰胺残留量。在停止饲喂后乳中三聚氰胺残留迅速降低，在停喂后的3d内残留基本消失。因此认为溶解态的三聚氰胺可顺利通过血乳屏障，并且三聚氰胺在牛奶中的残留性敏感，较低含量的饲料污染即可转化至牛奶中。

②奶牛饲粮中随三聚氰胺添加量的增加乳中尿素含量显著增加。而饲粮三聚氰胺(0.1% ～1.0%)对奶牛干物质采食量、产奶量和其他乳成分无影响。

［1］ USFDA.Melamine pet food recall of 2007［EB/OL］.2010－11－29［2012－03－26］.http://www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/petfood.html.

［2］ USFDA.Interim melamine and analogues safety/risk assessment［EB/OL］.2007 －05 －25［2012 －03 －26］.http://www.cfsan.fda.gov/～dms/melamra.html.

［3］ NEWTON G L，UTLEY P R.Melamine as adietary nitrogen source for ruminants［J］.Journal of Animal Science，1978，47(6):1338 －1344.

［4］ BROOME A W.The use of non-protein nitrogen in animal feeds［M］.London:J ＆ A Churchill Ltd.，1968.

［5］ 陈杰.家畜生理学［M］.4版.北京:中国农业出版社，2003:425－439.

［6］ CRUYWAGEN C W，STANDER M A，ADONIS M，et al.Hot topic:pathway confirmed for the transmission of melamine from feed to cow’s milk［J］.Journal of Dairy Science，2009，92(4):2046 －2050.

［7］ BURNS K.Recall shines spotlight on pet foods［J］.Journal of the American Veterinary Medical Association，2007，230(9)，1285 －1286.

［8］ BURNS K.Events leading to the major recall of pet foods［J］.Journal of the American Veterinary Medical Association，2007，230(11)，1600 －1620.

［9］ 中华人民共和国农业部.NY/T 34—2004奶牛营养需要［S］.北京:中国标准出版社，2004.

［10］ ISO.Milk and milk products-Guidance on sampling(ISO 707:2008) ［S］.［S.l.］:International Organization for Standardization，2008.

［11］ 王加启，于建国.饲料分析与检验［M］.北京:中国剂量出版社，2004.

［12］ VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A.Methods fordietary fiber，neutraldetergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］.Journal of Dairy Science，1991，74(10):3583－3597.

［13］ 中华人民共和国农业部.NY/T 1372—2007饲料中三聚氰胺的测定［S］.北京:中国标准出版社，2007.

［14］ USFDA.Updated FCCdevelopmental melamine quantitation(HPLC-UV)［EB/OL］.2007－04－02［2012－03－26］.http://www.fda.gov/cvm/melamine04022007.html.

［15］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 22388—2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［16］ MELNICK R L，BOORMAN G A，HASEMAN J K，et al.Urolithiasis and bladder carcinogenicity of melamine in rodents［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1984，72(2):292 －303.

［17］ OECD.OECD SIDS analysis UNEP publications:melamine［M］.［S.l.］:［s.n.］，2002.

［18］ CLARK R.Melamine crystalluria in sheep［J］.Journal of the South African Veterinary Medical Association 1966;37:349－351.

［19］ MACKENZIE H I.Melamine for sheep［J］.Journal of the South African Veterinary Medical Association，1966;37:153－157.

［20］ CLARK R，BARRATT E L，KELLERMAN J H.A comparison between nitrogen retention from urea，biuret，triuret and cyanuric acid by sheep on low protein roughagediet［J］.Journal of the South African Veterinary Medical Association，1965，36:79 －80.

［21］ HATFIELD E E，GARRIGUS U S，FORBES R M，et al.Biuret-a source of NPN for ruminants［J］.Journal of Animal Science，1959，18:1208 －1219.

［22］ BAYNES R E，SMITH G，MASON S E，et al.Pharmacokinetics of melamine in pigs following intravenous administration ［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46(3):1196 －1200.

［23］ 林祥梅，王建峰，贾广乐，等.三聚氰胺的毒性研究［J］.毒理学杂志，2008，22:216 －218

［24］ REIMSCHUESSEL R，GIESEKER C M，MILLER R A，et al.Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melamine and cyanuric acid to fish and pigs［J］.American Journal of Veterinary Research，2008，69(9):1217－1228.

［25］ BROWN C A，JEONG K S，POPPENGA R H.Outbreaks of renal failure associated with melamine and cyanuric acid indogs and cats in 2004 and 2007［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2007，19:525－531.

［26］ SATTER L D，ROFFLER R E.Nitrogen requirement and utilization indairy cattle［J］.Journal of Dairy Science，1975，58:1219.

［27］ KAUFMAN A J，STPIERRE N R.The relationship of milk urea nitrogen to urine nitrogen excretion in Holstein and jersey cows［J］.Journal of Dairy Science，2001，84:2284 －2294.

［28］ JONKER J S，KOHN R A，ERDMAN H A.Using milk urea nitrogen to predict nitrogen and utilization efficiency in lactatingdairy cows［J］.Journal of Dairy Science，1998，81:1681 －2692.