饲粮中添加海南霉素对奶牛瘤胃微生物区系的影响

辛杭书 段春宇 张永根 王明君 李仲玉 王志博 李富国

(东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030)

甲烷是反刍动物瘤胃正常消化的产物，瘤胃内排放的甲烷量占甲烷排放总量的15%～25%，而且反刍动物甲烷排放损失的能量占到饲料摄入能量的2% ～12%［1］。因此，抑制瘤胃甲烷的产生对提高饲料能量利用率和减轻温室效应具有重要的意义。海南霉素是近年中科院药物研究所研制的国内第1个羧基型聚醚类离子载体，它与瘤胃素、盐霉素结构相似，与莫能菌素有许多共同之处，是一种新型的反刍动物饲料添加剂［2］。它可以有效地降低反刍动物甲烷的排放量［3－4］，并具有保护瘤胃肽和可溶性蛋白质的作用［5－6］，能改变山羊瘤胃发酵类型，明显提高丙酸比例，抑制饲料蛋白质在瘤胃内的降解;在体外发酵试验中，能有效地减缓瘤胃液pH下降、减少产气量、减少氨态氮的含量、降低乙酸和丙酸比［7］，并且改变了瘤胃微生物区系。但体外试验有很多局限性，如果在动物饲粮中添加海南霉素是否同样会通过改变微生物区系来调控甲烷产量?调控机理是否相同呢?基于此，设计了本试验，旨在研究奶牛饲粮中添加海南霉素对其瘤胃微生物区系的影响，为海南霉素调控甲烷产生的机理性研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲粮组成

选用3头体况良好，体重相近(460.0±20.6)kg，安装有永久性瘤胃瘘管的健康荷斯坦奶牛。基础饲粮组成及营养水平见表1，精粗比为50∶50。海南霉素和莫能菌素分别由山东胜利股份有限公司和美国礼来公司赠送，纯度均≥90%，饲喂前混合于精料中饲喂。

1.2 试验设计

试验采用3×3拉丁方试验设计。试验设2个对照组:负对照组饲喂基础饲粮;正对照组在基础饲粮添加中350 mg/d莫能菌素。海南霉素组在基础饲粮中添加20 mg/d海南霉素。预试期10d，正试期5d，共15d。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(DM basis) %

1.3 饲养管理

试验在东北农业大学香坊试验基地进行。试验牛拴系饲养，每日饲喂2次(08:00和20:00)，先粗后精，自由饮水。

1.4 样品采集

每阶段正试期的第4、5天晨饲前(0 h)、晨饲后2、4、6、8和10 h于瘤胃腹囊处采集瘤胃液，用无菌的2层纱布过滤，用灭菌离心管取瘤胃液迅速放入液氮罐，带回实验室后于－80℃保存。用于基因组DNA的提取。

1.5 样品分析

1.5.1 瘤胃微生物总DNA的提取方法

采用珠磨－十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取总DNA，提取后，用紫外可见分光光度计测定提取的总DNA浓度和纯度，取符合样品的OD260nm与 OD280nm比值应在 1.6 ～1.8 之间(平均在1.75左右)，且用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA在加样孔附近呈现一致密亮带的样品待测，－20℃保存。

1.5.2 反转录PCR检测条件及引物的设计与合成

从瘤胃微生物总DNA中扩增细菌16S rDNA。

反转录 PCR反应体系:10×缓冲液2 μL，10 mmol/L的dNTP 0.4 μL，10 μmol/L 的引物各0.8 μL，25 mmol/L 的氯化镁(MgCl2)1.6 μL，模板总 DNA 0.4 μL，TaqDNA 聚合酶 2 μL，双蒸水为 13.6 μL，总体积为 20 μL。

反转录PCR反应参数:95℃变性7 min;95℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35个循环;72 ℃延伸7 min。

瘤胃微生物的16S rDNA全序列引物见表2［8］，本试验用到的所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.5.3 实时定量PCR(qRT-PCR)的反应条件及引物的设计与合成

qRT-PCR的反应条件参照SYBR Premix Ex TaqTM 试剂建立25 μL反应体系及反应条件［3］。qRT-PCR的引物参照文献［9－11］报道的瘤胃总细菌、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、真菌(fungi)、甲烷菌(Ruminococcus methanogen)和原虫(protozoa)引物序列(表3)。

表2 瘤胃微生物的16S rDNA全序列引物Table 2 Primers of whole length 16S rDNA of rumen microorganisms

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Sequences of primers for qRT-PCR assay

1.6 统计分析

根据测得的阈值循环(Ct)和以下公式［3］将目标菌含量表示为相对于瘤胃总细菌16S rDNA的百分比:

目标菌含量(%)=100 ×［2－(目标菌Ct－总细菌Ct)］。

试验数据用Excel初步记录并做简单处理，利用7500 System Software分析qRT-PCR结果。然后采用SAS 9.1软件包进行数据统计分析，并用混合模型(mixed procedure)进行多重比较。

2 结果

2.1 瘤胃微生物DNA的反转录PCR产物的电泳检测结果

利用1.5%琼脂糖凝胶电泳对反转录PCR产物进行检测的结果见图1。从产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、甲烷菌、原虫和真菌的基因扩增片段的电泳结果可以看出，每个扩增产物均与预期扩增片段大小相符，并且扩增所得的目的片段均呈1条的亮带，无杂带和拖尾现象，说明设计的引物及提取的基因组DNA均可用于qRT-PCR。

2.2 瘤胃微生物的qRT-PCR结果

运用qRT-PCR技术，对瘤胃产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、甲烷菌、原虫和真菌含量的变化进行监测。由表4可见，奶牛饲粮中添加海南霉素，极显著降低了溶纤维丁酸弧菌、原虫和真菌的含量(P＜0.01)，并且海南霉素对瘤胃微生物的抑制作用与莫能菌素正对照组相似。与负对照组相比，海南霉素将溶纤维丁酸弧菌、原虫和真菌的含量分别减少了 38.24%、60.24% 和 12.73%，差异极显著(P＜0.01)。而海南霉素和莫能菌素对瘤胃黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和甲烷菌的含量无显著影响(P＞0.05)。

由图2可见，海南霉素和莫能菌素对各个时间点的瘤胃溶纤维丁酸弧菌、原虫和真菌均有明显的抑制作用，并且各组每种菌的含量均随着时间的变化而发生变化，虽然变化规律并不是很一致，但均呈现一定的持续性。其中，海南霉素组和负对照组的溶纤维丁酸弧菌随着时间的增加而呈现先下降后升高再下降的趋势，而正对照组则呈现先升高后下降再升高的趋势;负对照组的原虫变化没有明显的规律，其他2组则随着时间的延长而呈现先升高后下降的趋势;真菌的变化规律比较一致，3组均为先升高后缓慢下降的趋势;各个时间点的产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的生长繁殖并没有被海南霉素和莫能菌素明显抑制，它们的含量也随时间变化而变化，但变化仍无明显的规律，其中，产琥珀酸丝状杆菌随着时间的延长而先升高后下降，白色瘤胃球菌随着时间的变化而呈现先下降后升高再缓慢下降的趋势，对于黄色瘤胃球菌，3组的变化均无明显的规律;海南霉素组和正对照组的甲烷菌含量与负对照组相似，均不受时间影响，且每组甲烷菌的含量始终稳定在0.46% ～0.48%。

图1 瘤胃细菌、真菌和原虫DNA反转录PCR结果Fig.1 Reverse transcription PCR results of DNA of bacteria，fungi and protozoa in the rumen

表4 饲粮中添加海南霉素对奶牛瘤胃微生物区系的影响Table 4 Effects ofdietary hainanmycin on rumen microflora ofdairy cows %

图2 饲粮中添加海南霉素对奶牛瘤胃细菌、原虫、真菌含量的影响Fig.2 Effects ofdietary hainanmycin on contents of bacteria，fungi and protozoa in the rumen ofdairy cows

3 讨论

瘤胃中的纤维降解细菌主要有黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸弧菌。据报道，莫能菌素和其他离子载体主要选择性抑制革兰氏阳性菌的生长，它们会在某些革兰氏阳性菌的细胞膜积累，催促离子快速向细胞内运动，导致无益的离子流，同时菌体ATP酶活性升高，产生大量的ATP来抵制无益的离子流动，最终会导致细胞内能量耗尽，进而抑制菌体的生长繁殖［12－13］。但革兰氏阴性菌不会被抑制，因为它的细胞膜外有一层脂多糖层，会抑制离子载体对细胞膜的入侵［14］。本试验发现，奶牛饲粮中添加海南霉素后，瘤胃溶纤维丁酸弧菌的含量显著降低，而黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌的含量无显著变化。溶纤维丁酸弧菌是革兰氏阳性菌，饲粮中添加海南霉素后，它的生长被抑制，而产琥珀酸丝状杆菌是革兰氏阴性菌，它的生长并没有被明显抑制。然而，黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌虽然都是革兰氏阳性菌，但这2种细菌的细胞膜外也有类似于革兰氏阴性细菌的脂多糖层，会抑制离子载体进入细胞膜，所以离子载体并不能有效抑制它们的生长［15－16］。

氢气是瘤胃中甲烷形成的一种重要底物，有研究表明，离子载体能抑制产氢菌的生长，从而抑制了甲烷生成的重要底物——氢气的积累，阻碍了合成甲烷的主要途径，最终抑制了甲烷的生成。本试验结果表明，饲粮中添加海南霉素和莫能菌素后瘤胃溶纤维丁酸弧菌含量显著降低，刘薇等［3］模拟瘤胃内环境在体外培养条件下研究海南霉素对瘤胃微生物影响的结果也表明，海南霉素抑制了溶纤维丁酸弧菌的生长繁殖，溶纤维丁酸弧菌的发酵产物主要由二氧化碳、氢气、乙醇、乙酸、丁酸、甲酸和乳酸。因此，当它的数量显著降低后，产生的氢气也会降低，所以其数量的降低导致瘤胃内氢气的生成减少，这也是瘤胃甲烷生成量降低的一个原因(甲烷产生量的数据见本课题组之前的研究报道［4］)。另外还有研究也表明，在饲粮中添加莫能菌素后，奶牛瘤胃溶纤维丁酸弧菌的数量显著降低［17］。

瘤胃中除大量的产氢气细菌外，也存在大量产生氢气的真菌，真菌在瘤胃发酵中产生乳酸、甲酸和乙醇等发酵产物，其中，大部分的产物都能被甲烷菌利用生成甲烷。同时在电子传递过程中产生氢气，这些真菌与甲烷菌之间存在着种间氢转移，它们产生的氢气会被甲烷菌利用合成甲烷，当真菌的生长受到抑制时，产物也会相应减少，而用于合成甲烷的底物的量就会减少，因此，甲烷的生成并将受到抑制。本试验结果表明，莫能菌素都显著抑制了瘤胃真菌的生长，这与Cann等［18］的研究结果一致，并且，Stewart等［19］研究也表明，莫能菌素能抑制无菌的半固体培养基中培养的真菌的生长，降低氢气的生成。本试验得出，海南霉素与莫能菌素的作用效果相似。

奶牛饲粮中添加莫能菌素显著降低了瘤胃原虫的数量，Nagaraja等［20］模拟瘤胃进行体外培养时发现，莫能菌素导致原虫数量大幅减少。由于甲烷菌和原虫有内外共生的特性，故原虫对于甲烷的生成亦有很大贡献，离子载体抑制瘤胃甲烷的生成可能与原虫数量下降有关，瘤胃原虫表面附着瘤胃产甲烷菌，与原虫形成共生体［21］。瘤胃原虫的细胞膜内壁结合有多种脱氢酶催化各自的底物脱氢，产生的氢分子附着在原虫上，而附着在原虫上的产甲烷菌则能够通过种间氢转移利用这些氢分子合成甲烷［22］。当原虫的数量降低时，产甲烷菌的可附着物减少，可利用的氢源减少，甲烷的生成量降低，并且减少了瘤胃发酵损失的能量。当饲粮中添加海南霉素时，瘤胃原虫数量也显著降低了，由此可见，海南霉素可能也存在与莫能菌素类似的影响机制。

Van Nevel等［23］研究表明，莫能菌素抑制瘤胃甲烷生成并不是对甲烷菌有特殊的毒害作用，而是抑制甲酸生成氢的反应。本试验结果表明，莫能菌素对甲烷菌的生长繁殖几乎没有影响，这与Weimer等［24］的试验结论相吻合，饲粮中添加莫能菌素后，产甲烷菌能适应饲粮添加莫能菌素的瘤胃环境，维持它们的数量。Hook等［25］通过6个月的试验，采用qRT-PCR方法研究了莫能菌素对瘤胃产甲烷菌数量的影响，结果表明，莫能菌素没有显著影响瘤胃产甲烷菌的数量。饲粮中添加海南霉素后，瘤胃甲烷菌的数量也没有显著变化，说明海南霉素与莫能菌素相似，都没有影响瘤胃甲烷菌的数量。由此可见，海南霉素和莫能菌素降低瘤胃甲烷的生成量并不是直接作用于瘤胃甲烷菌，而是作用于和甲烷生成相关菌或改变瘤胃发酵类型等方式来实现的。

4 结论

饲粮中添加海南霉素改变了瘤胃微生物区系，海南霉素对瘤胃产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和甲烷菌含量无显著影响，但显著降低了溶纤维丁酸弧菌、原虫和真菌含量。

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