鸡源大肠杆菌在亚抑菌浓度头孢菌素诱导下的体外耐药表型

苑 丽，吴 华，潘玉善，刘建华，胡功政

（河南农业大学，河南郑州 450002）

目前禽源临床分离致病菌的多重耐药现象较为严重[1-4]，为兽医临床有效防控该细菌病造成了一定困难。细菌获得多重耐药的因素有很多[5]，其中临床不合理用药是重要的原因之一。为研究临床用药对细菌产生耐药性的影响，本实验选取临床分离株LG30鸡源大肠杆菌（Escherichia coli）和标准株O78为研究对象，采用亚抑菌浓度的头孢曲松或头孢噻肟单药为诱导药物，检测不同诱导期的诱导菌对常用药物的耐药性变化，为临床合理用药及进一步研究禽源分离菌的多重耐药机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 受试菌株LG30鸡源E.coli为本实验室临床分离鉴定并保存；标准株O78购自中国兽药监察所；氨苄西林（新乡华星药厂，含量89.6%，批号070803）、头孢曲松（广州白云山制药总厂，含量94.8%，批号070860）、头孢噻肟钠（齐鲁动物保健品有限公司，含量89.1%，批号070400301）、头孢噻呋（美国法玛西亚普强公司，含量95.8%，批号070406）、盐酸头孢吡肟（悦康药业集团有限公司，含量89.4%，批号0705051）、加替沙星（台州外高桥联通药业有限公司，含量99.5%，批号061022）、恩诺沙星（浙江康裕制药有限公司，含量98%，批号070509）、克林沙星、庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考等均为国产药，使用时均在有效期内。

1.2 菌种复活及培养 将各保存菌液50μL分别接种于5 ML LB肉汤中，37℃培养18 h～24 h，接种于LB琼脂平板，37℃过夜培养。次日，分别挑取平板上1～2个典型菌落接种于LB肉汤，37℃培养18 h～24 h，4℃保存作为种用。

1.3 体外药敏试验 参照CLSI（2010）[6]推荐的微量稀释法测定各受试药对细菌的最小抑菌浓度（M inimal inhibitory concertration，M IC）值，并分析各受试药物的耐药率。试验时，受试菌的菌悬液浓度约为105cfu/mL。试验重复3次，结果取平均值。

1.4 诱导培养 将新鲜培养的受试菌液0.5 ML接种于4 ML LB肉汤中，再加入0.5 ML适量浓度的头孢曲松或头孢噻肟，使肉汤内的药物浓度为相应菌株的1/2 MIC，37℃培养18 h~24 h，计为培养一代。每天继代一次，共计培养30代，每隔3代做一次体外药敏试验，调整肉汤中的药物浓度，使之始终保持约1/2 MIC。每隔10代如上法做体外药敏试验。

2 结果与讨论

不同代次不同药物诱导菌株对氨苄西林、庆大霉素和恩诺沙星等11种常见抗菌药的体外药敏试验结果见表1。

2008年，M iranda等在研究648株鸡源E.coli对恩诺沙星、多西环素和磺胺等三类药物使用期、残留期及未用药期的耐药率差异时表明，在用药期间鸡源E.coli的耐药率显著升高，并由此推断鸡群中应用抗菌药将有助于鸡源E.coli筛选出耐药菌株[7]。在本实验中，由表可知，受试菌诱导前对受试药均呈现敏感，各药的M IC值为<0.13μg/mL～8μg/mL。菌株在含有适量头孢噻肟或头孢曲松的LB肉汤中连续培养至10代时，O78诱导菌对头孢噻肟和头孢曲松的敏感性均有明显降低，两药的M IC值升高了8倍～64倍，但O78诱导菌仍保持敏感。当诱导培养至20代时，O78诱导菌对两药的敏感性继续下降，两药的M IC值又升高了2倍～16倍，并且头孢噻肟诱导的O78菌已对三代头孢产生耐药。此外，4个20代诱导菌除了对头孢吡肟仍保持敏感，对加替沙星和克林沙星呈敏感或中介外，对其他种类的药物（包括庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考及恩诺沙星）均已呈现耐药。当继续诱导至30代时，各菌株对药物的敏感性进一步降低，耐药程度进一步增强，但各药的M IC值升高速率减慢。表明在头孢类抗菌药的持续性选择性压力下，细菌获得多重耐药表型的速度是非常快速的，并且不同药物诱导的菌株对药物的敏感性差异仅与诱导代数密切相关，与诱导药物（头孢噻肟和头孢曲松）的品种无明显关系。有意思的是，细菌通过此种方式获得的耐药表型并不仅仅针对诱导药物，而是以几乎相同的速度向多重耐药发展，即在头孢类药物诱导下，细菌不仅能够对头孢类药物产生耐药，而且还能够同时对其他种类药物产生耐药，从而突变为多重耐药菌株[8-9]。分析原因可能是诱导菌在药物选择性压力下发生了非特异性的适应性改变，如细菌的细胞膜通透性下降、细菌产生了多药外排泵或细菌形成了生物被膜等[10-11]。

表1 受试菌对11种抗菌药物的敏感性检测结果（μg/mL）Table 1 The susceptibilities of isolates against antim icrobial agents（μg/mL）

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