马媾疫锥虫SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

王 群，郑小龙，朱来华，肖西志，邓明俊，岳志芹，孙 涛，赵玉然

（山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002）

马媾疫（Dourine）是由锥虫属（Trypanosoma）的马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）寄生于马属动物的生殖器官所引起一种寄生虫性传染病。该病不同于其他锥虫病，可通过感染马与健马交配传染[1]。

目前，国内对于媾疫锥虫病的诊断主要是通过病原学和血清学检测两种方法。病原学诊断虽然可以确诊，但费时费力，而且检出率低[2]。血清学诊断中ELISA基本上是全虫提取抗原，特异性较差；补体结合试验操作繁琐耗时，而且影响因素过多，判定比较困难。研究显示，锥虫不同亚种虫株的基因组中存在某些差异[3-4]。本研究利用锥虫基因组中存在的差异，通过荧光定量PCR技术建立了一种特异的、快速的媾疫锥虫检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和虫株 马鼻肺炎病毒（Equid herpesvirus，EHV）、马动脉炎病毒（Equine arteritis virus， EAV）和 马 流 感 病 毒 （Equine influenza virus，EIV）由本实验室保存；马媾疫锥虫美国株基因组、伊氏锥虫美国株基因组和马焦虫德克萨斯株基因组由本实验室保存。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒、ExTaqPCR试剂盒、连接试剂盒、DH5a、pMD18-T、DNA Marker DL2000和AMV反转录酶均购自TaKaRa公司；Power SYBRRGreen PCR Master Mix购自ABI公司；PureLink Micro-to-M idi Total RNA Purification System购自Invitrogen公司。

1.3 引物设计 根据GenBank登录的马媾疫锥虫Maxicircle DNA基因序列（EU185800.1），参照文献[3]的报道，选择其保守区域，利用Primer primer5.0软件设计一对基因片段克隆引物，D1-F：5'-TGGGTTTATATCAGGTTCATTTATG-3'和 D1-R：5'-CCCTAATAATCTCATCCGCAGTACG-3'。

选取保守区域设计荧光定量PCR的引物，P1：5'-TGTTTTATAGTATTTTACGCA-3'和 P2：5'-ATCT CATCCGCAGTACGCTGT-3'，扩增长度为 151 bp，由TaKaRa公司合成。

1.4 病毒DNA和RNA的提取及其cDNA的制备各取病毒液100μL，按照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，-20℃保存备用。

取病毒液100μL按照试剂盒的说明书提取病毒RNA，用AMV反转录酶按照说明书反转录合成cDNA。

1.5 马媾疫锥虫基因特异性保守片段的扩增 以马媾疫锥虫基因提取物为模板，采用引物D1-F、D1-R进行PCR扩增。反应条件为 94℃ 5 Min；94℃1 Min，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃10 Min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.6 SYBR GreenⅠ荧光PCR标准品的制备 将PCR产物切胶回收，连接至pMD18-T载体，转化DH5α，37℃培养过夜，挑取单个菌落，扩大培养后提取重组质粒，挑选经PCR鉴定正确的重组质粒，由上海英骏（Invitrogen）生物技术有限公司测序。将测序正确的重组质粒命名为pMD-Dourine。

提取重组质粒，用Pico drop测定质粒浓度，参照以下公式计算拷贝数：copies=ng×10-9×6.02×1023/碱基数×345。

1.7 SYBR GreenⅠ荧光PCR反应体系和反应条件的优化 以样本阈值循环数（Ct值）、产物荧光值、标准曲线斜率和相关系数等为标准，分别对PCR反应体系中的引物、dNTP、Mg2+浓度和反应参数中退火温度、读板温度进行优化。

1.8 标准曲线的建立 用10倍系列稀释法处理pMD-Dourine为标准品。取6个浓度梯度（105、104、103、102、101、100拷贝）质粒标准品作为模板，以优化的反应体系和反应参数进行 SYBR GreenⅠ荧光PCR反应。根据荧光实时PCR的动力学曲线，检测仪系统自动生成标准曲线以及回归方程。

1.9 SYBR GreenⅠ荧光PCR方法特异性、敏感性试验 分别提取马EHV、EAV、EIV、马媾疫锥虫、马伊氏锥虫和马焦虫的核酸，用所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR进行检测，设无模板阴性对照。收集荧光信号，检测其特异性。

用ddH2O对标准模板进行10倍系列稀释，用所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对各个稀释的样品进行检测。与此同时，将10倍系列稀释的标准模板进普通PCR检测，电泳观察结果。

1.10 SYBR GreenⅠ荧光PCR方法的重复性试验将10倍系列稀释的标准品在同一时间、同一地点做3次重复以及在不同时间，不同地点做3次重复，根据优化的SYBR GreenⅠ荧光PCR反应体系和反应条件进行重复性试验。并分别计算组内及组间的变异系数。

2 结果

2.1 标准阳性模板的制备 将扩增得到的马媾疫锥虫基因特异性保守片段克隆至pMD-18T载体中，利用PCR对构建的重组子进行鉴定，得到约400 bp的片段（图1）。测序结果为395 bp，与GenBank中登陆序列（EU185800.1）同源性达到100%。

2.2 标准曲线的建立 利用试剂盒提取pMD-Dourine重组质粒，并测定其OD值，通过公式计算得到其浓度为3.8×1010拷贝/μL。稀释质粒至1.0×109拷贝/μL作为原液使用。

将含有1.0×109拷贝/μL的重组质粒原液10倍倍比稀释，分别以 1拷贝 /μL～1.0×105拷贝 /μL稀释度的重组质粒为标准品进行定量PCR扩增。用Sequence Detector software进行数据分析，以起始模板的拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线（图2）。图2显示，Ct值与拷贝数浓度在1拷贝/μL～1.0×105拷贝/μL之间呈线性关系，而且R2为0.995。荧光定量PCR的溶解曲线图显示，标准品扩增产物的溶解温度为71℃（图3）。

图1 重组质粒pMD-Dourine的PCR鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant plasm id

图2 采用SYBRGreenⅠ实时定量PCR检测标准曲线Fig.2 Standard curve of Dourine detected by SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.3 SYBR GreenⅠ荧光PCR方法特异性、敏感性 使用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对EHV、EAV、EIV、马焦虫、伊式锥虫和马媾疫锥虫的阳性DNA样本进行检测，只有马媾疫锥虫样本呈现扩增曲线（图4）。将标准品质粒10倍比稀释，图5中试验结果显示，所建立的检测方法在1拷贝/μL时，仍有荧光信号。

2.4 荧光定量PCR的重复性试验 分别以105、104、103、102、101和 100拷贝 /μL 的 pMD-Dourine为模板进行组内及组间的重复性试验，记录Ct值并计算变异系数（表1）。通过计算组内的变异系数为0.305%～3.360%，组间变异系数为1.491%～3.183%，表明该方法具有良好的重复性。

图3 标准品的熔解曲线Fig.3 Themelting curve of standards

图4 马媾疫锥虫实时定量PCR特异性检测Fig.4 Specificity of the real time PCR method for detecting T.equiperdum

表1 SYBR GreenⅠ实时荧光PCR的组内、组间重复性实验结果Table 1 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the SYBR Green I real-time PCR

图5 标准品质粒扩增曲线Fig.5 The amplification curve of standard plasm ids

4 讨论

随着经济全球化的进展，国际间马匹的交流也越来越频繁，建立快速高效敏感的马病检测方法，对于保障人们的健康和预防疫情的爆发具有重要意义。本实验采用SYBR GreenⅠ染料法建立了马媾疫锥虫的荧光PCR检测体系。

近年来荧光定量PCR技术凭借其自身检测范围宽、敏感性高、精确度高、无PCR后处理步骤、无交叉污染及高通量，可以进行多重检测等优点，广泛的应用于各个研究领域[5-6]，成为目前应用的最热门的技术之一。

由于SYBR GreenⅠ与双链DNA的结合是非特异性的，在PCR过程中产生非特异产物或引物二聚体对定量结果均有影响，因此需要优化反应条件，并对产物进行熔解曲线分析。Li等研究显示在马媾疫锥虫与伊式锥虫的动肌体基因中存在差异[3]，本研究根据对GenBank中登录的锥虫的动肌体基因对差异序列进行了分析，通过软件设计了特异性引物，从根本上避免了PCR扩增过程中非特异性扩增的发生。同时本研究中通过对MgC12反应浓度和引物浓度的优化，减少了引物二聚体的产生和影响，并且反复试验，溶解曲线图中显示，试验中并无非特异性扩增的影响。

本实验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，对马媾疫锥虫DNA的检测下限达到10拷贝；特异性试验表明，该方法对马伊氏锥虫、马焦虫、EHV、EAV、EIV无交叉反应，具有良好的特异性。综上所述，本实验建立了灵敏、快速、特异的马媾疫SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，该方法在进出境动物检验检疫、流行病学调查及寄生虫病原鉴定中具有重要的应用价值。

[1]王玉玲.马媾疫微量补体结合的改良试验[J].中国动物检疫，2003，20（6）：23-25.

[2]董文其，孙恩贵，刘俊华.媾疫锥虫、伊氏锥虫差异抗原的分离鉴定[J].中国畜禽传染病，1993，69（2）：46-47，41.

[3]Li Feng-jun,Gasser R B,Lai De-hua,et al.PCR approach for the detection ofTrypanosomabrucei andT.equiperdumand their differentiation fromT.evansibased on maxicircle kinetoplast DNA[J].Mol Cell Probes,2007,21（1）:1-7.

[4]Claes F,Radwanska M,Urakawa T,et al.Variable surface glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection ofTrypanosoma evansiinfections[J].Kinetoplastid Biol Dis,2004,3（1）:3.

[5]Kimberly E R,Hansjuerg A,Hagan JP,et al.The detection of differentially expressed MicroRNAs from the serum of ovarian c ancer patients using a novel real-time PCR platform[J].Gynecol Oncol,2009,112（1）:55-59.

[6]M itas M,M ikhitarian K,Walters C,et al.Quantitative real-time RT-PCR detection of breast cancer Micrometastasis using a multigene Marker panel[J].Int JCancer,2001,93（2）:162-171.