猪圆环病毒2型胶体金抗体检测方法的建立

张文通，魏 凤，王金良，肖跃强，沈志强,

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪圆环病毒 2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[1-2]。PMWS主要发生于5周～12周的断奶仔猪，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。病原学及血清学调查表明，该病在许多国家广泛存在，给养猪业造成严重的经济损失。因此，建立一种PCV2抗体的快速检测方法，为该病的预防提供依据十分重要。

PCV2包括两个主要的开放阅读框：ORF1和ORF2；ORF2编码的Cap蛋白是PCV2主要结构蛋白。Truong等研究表明，ORF2抗原表位可以作为PCV2实验猪及自然感染猪血清学检测的标志[3]。目前诊断PCV2的血清学方法主要有ELISA、免疫酶组织化学染色法和免疫荧光等方法。但这些方法由于费时或成本高等因素的制约，只能用于实验室的诊断，不适合大量样品的检测。本实验应用胶体金标记技术，根据免疫层析原理，用胶体金标记葡萄球菌蛋白A（SPA）作为探针，用纯化的重组ORF2蛋白和健康猪IgG分别作为检测线和对照线试剂，研制一种PCV2抗体胶体金试纸条。该试纸条具有检测快速和使用方便等优点，可以适用于临床样品的大量检测，为PCV2抗体检测提供了有效的工具。

1 材料和方法

1.1 病毒株、重组菌及血清 SPA购自Prospec公司；猪圆环病毒抗体检测ELISA试剂盒、pKGORF2/BL21重组菌以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、PCV2免疫血清均由滨州畜牧兽医研究院制备保存。

1.2 主要材料与仪器 硝酸纤维素膜、玻璃纤维垫、吸收垫及背衬等层析材料购自M illipore公司；GST标签蛋白亲和层析纯化柱为Amersham Biosciences公司产品；BCA法蛋白质定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；ZX1000喷点平台系统、CM 4000试纸条切刀为美国Biodot公司产品；透射电子显微镜为Tokyo产品。

1.3 纯化重组ORF2蛋白的制备 将pKG-ORF2/BL21菌于500 ML液体LB培养基中37℃摇菌培养至OD600nm值达0.6时，加IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导表达6 h；8 000 r/m in离心10 Min，沉淀用1/10体积缓冲液A（Tris-Cl 50m M/L、EDTA 0.5 mM/L、NaCl 50 mM/L、Glycerol 5%（W/V））重悬，添加DTT至终浓度为10 mmol/L，超声波破碎。4℃条件下12 000 r/m in离心10 Min。沉淀中加入19.7 ML缓冲液A及0.3 ML 20%SKL贮存液，搅动溶解，静置 30 min～2 h，4℃ 12 000 r/m in离心 10 Min，取上清，加入20%PEG 4 000至终浓度为0.2%，加50mmol/L的氧化型谷胱苷肽至终浓度为1mmol/L，加100mmol/L的还原型谷胱苷肽至终浓度为2mmol/L，静置30 min～2h，PBS透析2 d～3 d，将上清浓缩至5 ML，按GST标签蛋白亲和层析纯化柱说明书进行纯化，得到纯化的重组ORF2蛋白。BCA法测定蛋白浓度。

1.4 胶体金及金标SPA的制备 参照文献[4]并稍作优化，取100 ML三蒸去离子水于平底烧瓶中，加入2m L预先配制的1%氯金酸溶液，在恒温磁力搅拌器上加热沸腾，快速搅拌下迅速加入1.8 ML 1%柠檬酸三钠溶液，待溶液变为葡萄酒红色后再加热15m in。自然冷却至室温，三蒸水定容后，0.1mol/mL K2CO3调节pH6.5。将20 ML胶体金快速搅拌下缓慢加入200μL（1mg/mL）SPA蛋白，持续搅拌30min后，加入2.5m L 10%BSA溶液，继续搅拌30min。4℃8 700 r/min离心45 Min，沉淀用含0.5%PEG 20 000的0.005 mol/L PBS（pH7.2）重悬至原量，10 000 r/min重复离心2次，用1 ML含1%BSA的0.01mol/L PBS（pH7.2）重悬沉淀，4℃保存备用。

1.5 金标快速检测试纸条的组装 试纸条由样品垫、金标SPA结合垫、NC膜和吸水垫4部分组成。首先将样品垫（玻璃纤维）和金标抗体结合垫（玻璃纤维）用含有2%BSA、2.5%蔗糖、1%吐温20、0.3%PVPk30以及0.02%叠氮钠的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）封闭，于37℃温箱中干燥。采用点膜仪将金标SPA喷涂于玻璃纤维上，喷涂量为12μL/cm，抽真空干燥。采用点膜仪分别将2 mg/mL猪IgG和1mg/mL纯化重组ORF2蛋白喷涂于NC膜上，间隔1 cm，作为检测线和质控线，37℃温箱中干燥1 h。最后将样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水纸依次粘贴在塑料底板上，切割成3.5 mm宽的试纸条，密封后于4℃保存备用。

1.6 检测方法及结果判定 将试纸条插入到含100μL样品的加样孔中，10m in内判定结果。检测线上出现红色条带为阳性；检测线上无红色条带为阴性；质控线无条带则试纸条无效。

1.7 试纸条的批内和批间重复试验 对同批和不同批次的试纸条分别进行特异性及灵敏度试验，观察其重复性。

1.8 试纸条稳定性试验 将试纸条存放于室温，每30 d检测标准阳性及阴性样品，观察其特异性以及灵敏度的变化。

1.9 临床样品检测 采用制备的胶体金试纸条检测320份临床猪血清样品。PCV2抗体胶体金试纸条的使用方法：将血清样品以样品稀释液（0.85%生理盐水）稀释100倍，将试纸条插入进行检测，10m in内判断结果。同时以ELISA方法同时检测作为对照。

2 结果

2.1 重组ORF2蛋白的制备及纯化 将重组ORF2蛋白制备并纯化后，进行SDS-PAGE检测，结果显示，蛋白大小约为45 ku，并且具有较高的纯度（图1）。蛋白浓度为1.592mg/mL。

图1 重组ORF2蛋白纯化的SDS-PAGE结果Fig.1 SDS-PAGE results of purified recombinant ORF2 protein

2.2 胶体金制备及鉴定 制备的胶体金外观呈葡萄酒红色。透射电镜观察，胶体金颗粒大小形状均匀，分散，颗粒直径约为20 nm（图2）。

图2 胶体金的电镜照片Fig.2 TEM image of collidal gold particles

2.3 特异性试验 采用制备的试纸条对0.85%生理盐水以及 PCV2、HCV、PRV、PPV、PRRSV、PEDV免疫血清进行特异性交叉试验。结果显示PCV2免疫血清呈阳性反应，而0.85%生理盐水及其他血清均呈阴性反应（图3），表明该方法具有高度的特异性。

图3 试纸条特异性试验Fig.3 Specificity of the immunochromatographic strip

2.4 敏感性试验 以0.85%生理盐水倍比稀释PCV2免疫血清并进行检测，结果显示当稀释至1∶1 280时，结果仍呈阳性，而1∶2 560时呈阴性（图4）。

2.5 重复性及稳定性试验 对不同批次的PCV2抗体检测试纸条进行批内和批间重复性试验，符合率为100%。室温下保存6个月，其特异性及灵敏度无任何变化。

2.6 临床样品检测 用试纸条对临床采集的324份血清样品进行检测，同时以ELISA试剂盒检测作为对照，试纸条检出率为88.58%，而ELISA试剂盒为89.20%，两者的符合率为98.77%（表1）。

表1 临床血清样品检测结果Table1 Clinical application of ELISA and Strips

3 讨论

本研究利用胶体金为示踪物，SPA蛋白和重组ORF2蛋白间接法研制了PCV2抗体胶体金试纸条。通过对PCV2阳性血清样品的比较测定，试纸条所测得的抗体滴度比ELISA低1个～2个滴度，而与猪其他病毒的免疫血清无交叉反应。试纸条在室温存放4个月，特异性和敏感性无任何变化，表明其具有高度稳定性。对临床采集血清样品阳性检出率为88.58%，与ELISA试剂盒总符合率为98.77%。由此表明，本研究研制的试纸条具有特异、敏感、稳定等特点。

与目前PCV2的血清学诊断方法相比，本研究建立的试纸条快速、准确、灵敏，可以凭肉眼在10min内判定结果，操作简单，普通的养殖户即可现场使用。该方法可以用于大批量、大范围的PCV2抗体调查。

本研究建立了PCV2抗体胶体金免疫层析检测方法，研制的试纸条对PCV2抗体具有很高的特异性和敏感性。临床应用表明试纸条使用方便、快捷并且操作简单，适合对PCV2抗体进行现场检测。该方法的建立为PCV2流行病学调查及预防控制奠定了基础。

[1]Allan G M,Mcneilly F,Kennedy S,et al.Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs w ith a wasting disease in the USA and Europe[J].JVet Diagn Invest,1998,10（1）:3-10.

[2]Allan G M,Meehan B,Todd D,et al.Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes[J].Vet Rec,1998,142:467-468.

[3]Truong C A,A lbina E.Identification of an immunorelevant ORF2 epitope from porcine circovirus type 2 as a serolofical marker for experimental and natural infection[J].Arch Virol,2001,146:1197-1211.

[4]Grabar K C,Griffith F R,Hommer MB,et al.Preparation and characterization of Au colloid monolayers[J].Anal Chem,1995,67（4）:735-743.