版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测

赵 跃，王 锐，霍金龙，刘丽仙，霍海龙，杨成海，曾养志2,

（1.云南农业职业技术学院畜牧兽医系，云南昆明 650031；2.云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室，云南昆明 650201；3.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201）

版纳微型猪近交系（Banna Mini-pig inbred line，BM I）是云南农业大学曾养志教授通过引入云南省西双版纳州拉祜族寨子中已有相当近交程度的母猪及其仔猪，采用全同胞或亲子交配两种高度近交方法，严格选择、精心培育的大型哺乳类动物近交系。具有遗传背景清楚、基因纯合度和一致性高等优点，它将为生物医学实验、转基因及基因修饰动物研究、异种器官移植等领域的研究工作提供纯系实验动物模型[1-4]。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是生长因子家族中最强的促血管内皮细胞有丝分裂原，是血管生成必不可少的重要参与因子，能够特异性刺激血管内皮细胞增殖，促进血管生成，增强血管的渗透性[5]，与多种肿瘤的复发转移及预后密切相关[6]，并与肿瘤生物行为相关[7-8]。本研究以版纳微型猪近交系为实验动物，采用RT-PCR方法克隆VEGF基因，同时对18种组织进行转录水平检测，为下一步以版纳微型猪近交系为实验动物研究人类VEGF基因的功能以及研究人类多种疾病奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂 迫杀版纳微型猪近交系6月龄、体质量12 kg的母猪1头，取淋巴结、中脑、卵巢、间脑、大脑、肝、肾、脾、心、肺、神经纤维、胃、小肠、大肠、胰、皮肤、肌肉、脂肪18种样品，液氮速冻，-80℃保存；RNAiso Plus、RNA PCR Kit（AMV）反转录试剂盒、Agarose Gel DNA Purification Kit等试剂盒以及pMD18-T Vector、E.coliCompetent Cells DH5α、DL2000 DNA Marker等均购自TaKaRa公司。

1.2 RNA提取及cDNA合成 按试剂盒步骤提取组织样品总RNA。利用核酸蛋白定量仪检测RNA的浓度及纯度（OD260nm/OD280nm）。采用RNA PCR Kit进行逆转录反应。cDNA合成体系：0.5μg的Total RNA，0.5μL 的 2.5μmol/L Oligo dT-Adaptor Primer，1μL的 10mmol/L dNTPm ix，1μL的10×RT Buffer，2μL 的 25 mmol/L MgCl2,0.5μL的 5 U/μL AMV Reverse Transcriptase， 0.25 μL 40 U/μL 的 RNase Inhibitor，DEPC-treated water补齐至10μL。反应条件为：30℃10min，50℃30m in，95℃5m in，5℃5 Min。

1.3 PCR引物设计及合成 根据序列EU714324，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计特异引物扩增VEGF全长编码区及部分侧翼序列共847 bp的片段，并根据测序得到的版纳微型猪近交系VEGF编码区序列，设计特异引物扩增155 bp片段，用于多种组织RT-PCR，并以18S看家基因为内参扩增145 bp片段（表1），均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 VEGF和18S基因的PCR引物Table 1 PCR primers of VEGF and 18S

1.4 PCR扩增 利用25μL反应体系：12.5μL的GC BufferⅠ，10μmol/L引物各 0.5μL，4μL的2.5 mmol/L dNTPm ix，0.25 μL 5 U/μL TaqE，1 μL 25 ng/μL cDNA，6.25μL ddH2O。扩增条件为：94℃1 Min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min，40个循环；4℃。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 目的基因的克隆和鉴定 取切胶回收的纯化产物与pMD18-T载体连接，反应体系：1μL pMD18-T载体，3μLDNA目的片段，1μL水，5μLSolutionⅠ。恒温循环水浴16℃连接16 h后转化E.coliDH5α感受态细胞，过夜培养，通过菌落蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定后，阳性菌液由北京百泰克生物技术有限公司利用通用引物M 13进行测序。

1.6 多种组织RT-PCR扩增 分别以18种组织的cDNA为模板，利用F2/R2引物进行PCR扩增，同时以18S看家基因做内参对照。产物经琼脂糖凝胶电泳分离目的片段。

1.7 数据编辑和分析 测序结果使用DNAStar软件初步编辑、比对，人工校对，并推导出氨基酸序列，利用ClustalX、MEGA4等软件进行氨基酸同源性比较，并构建多物种系统进化树。

2 结果

2.1VEGF基因RT-PCR扩增结果 以BM IcDNA为模板，采用特异性引物F1/R1对VEGF基因进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增约850 bp的目的片段，与预期结果（847 bp）相符（图1）。

图1 VEGF基因RT-PCR扩增结果Fig.1 The amplification of VEGF gene by RT-PCR

2.2VEGF基因信息及对应蛋白的保守结构域分析通过对PCR产物及克隆后提取的阳性质粒双向测序，得到一条长度为847 bp的cDNA整合序列，GenBank登录号为JF831364，其中包含573 bp的全长CDS序列，编码190个氨基酸（图2）。

2.3 BM I等9个物种的分子系统进化树 利用DNAstar、Mega、Cluster、DNAMan 等生 物 信 息 学软件将由版纳微型猪近交系VEGFCDS序列推导的氨基酸序列与牛（NP_776641）、猫（NP_001009 854）、兔（ACA23169）、人（AAC63143）、绵羊（AAD29683）、马 （NP_001075290）、 大 鼠 （AAA4 1211）、 小 鼠（AAB22253）的氨基酸序列进行比对，相似性分别为97%、97%、97%、96%、96%、96%、91%和91%。利用VEGF的氨基酸序列构建了BM I猪、牛、猫、兔、人、绵羊、马、大鼠、小鼠9个物种的系统进化树（图3）。

2.4 多组织转录水平检测 根据测得的VEGF全长编码区序列设计特异性引物F2/R2扩增VEGF 155 bp片段，同时以看家基因18S为内参（扩增145 bp片段），检测BM I 18组织的转录水平（图4）。

图3 VEGF分子系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree based on VEGF am ino acid sequences

图4 VEGF基因多组织转录水平检测结果Fig.4 The transcription level of VEGF gene in different tissues of BM I

3 讨论

VEGF基因在免疫反应等方面起着重要的作用[9-10]，为深入了解猪VEGF基因mRNA在各组织中转录水平上的表达情况，本研究克隆版纳微型猪近交系VEGF基因全长编码区序列，利用Protein BLAST工具对所推导的VEGF蛋白氨基酸序列进行检测，显示存在PDGF/VEGF超家族的特征（aa 49~aa 132）。比较版纳微型猪近交系VEGF基因CDS编码 区 和 GenBank内 录入 的 EU714324、X81380、AF318502、NM_214084等猪VEGF基因 CDS编码区，显示版纳微型猪近交系VEGF序列（JF831364）和EU714324序列完全一致。与X81380序列在编码区的 第 15位 不 同（c.15C>G）， 与 AF318502及NM_214084序列在第 304位（c.304A>G）和 438位（c.438A>G）不同，其中第15位和第438位为密码子第3位碱基突变，编码的氨基酸没有发生改变，仅第304位为密码子第1位碱基发生突变，导致在BM I中编码的氨基酸为苏氨酸，而在AF318502及NM_214084序列中编码的氨基酸为丙氨酸。BM I VEGF氨基酸和牛、猫、兔、人、绵羊、马、大鼠、小鼠8个物种的VEGF氨基酸序列进行比对分析表明，相似性均在90%以上，表明VEGF基因在进化中保守性较强。以18S rRNA为内参对照校正的多组织表达谱表明BM IVEGF基因在各脏器中均有转录水平的表达，但在各脏器中又存在明显的差异表达现象，在卵巢、脾、心、肺及皮肤中表达量明显高于其他组织。

猪是研究各种疾病的最佳模型动物之一，版纳微型猪近交系是利用我国特有地方猪种资源，历经30余年连续高度近交培育的世界上第一个大型哺乳类实验动物近交系，它将为生命科学多个领域的研究提供大型纯系哺乳类实验动物。9个物种进化关系分析显示版纳微型猪近交系VEGF基因与人类VEGF基因关系最近，与牛、羊、兔、猫、马、大鼠及小鼠关系略远，这也提示版纳微型猪近交系是研究人类VEGF基因较好的实验动物模型，其不仅可以为人类各种肿瘤、肾脏及肝脏疾病、糖尿病等的研究提供最佳实验动物模型，在不久的将来也可以为猪→人异体器官移植提供大量供体器官。

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