卡托普利对心力衰竭大鼠心肌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响*

王艳飞,王红英,曹雪滨△,任 越,张 刚,何建成,胡元会

(1.解放军二五二医院,河北 保定 071000;2.保定市第五医院,河北保定 071001;3.上海中医药大学基础医学院,上海 201203;4.中国中医科学院广安门医院,北京 100053)

细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种重要形式,即程序性细胞死亡。自1972年Kerr等首次提出细胞凋亡以来,凋亡一直是医学界的研究热点。凋亡使工作心肌细胞绝对数量减少,而导致心肌收缩力下降。越来越多的研究结果表明细胞凋亡与慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的发生和发展密切相关[1,2]。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-conveting enzyme inhibitor,ACEI)主要针对神经-体液反应,可改善症状,降低死亡率。本实验通过建立压力超负荷心衰大鼠模型,经ACEI类药物卡托普利治疗后,观察其对心衰大鼠心肌细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响,进一步研究卡托普利治疗慢性压力超负荷心衰的可能机理。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与实验药品

流式细胞仪(EPICS-XLⅡ,美国Beckman Coulter公司);Bax单克隆抗体(克隆号B-9,编号I1004);Bcl-2单克隆抗体(克隆号C-2,编号G3106);均为美国Santa-Cruz公司产品。卡托普利:25 mg/tablet,批号:国药准字H32023731(江苏省常州制药厂)。

1.2 实验动物

SD大鼠(清洁级Ⅱ),雄性,体重(200±25)g,90只,由军事医学科学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(京)2003-1-003,合格证编号:610119。

1.3 动物模型分组、制备及给药方法

分组:随机将90只大鼠分为3组(n=30):假手术组(SH)、腹主动脉缩窄组(CAA)、卡托普利治疗组(CAP)。动物模型制备[3]:10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。经左脊肋角区入路,结扎腹主动脉缩窄50%～60%。假手术组:腹主动脉下穿线后打一松结。给药方法:SH组及CAA组给予生理盐水4 ml灌胃,CAP组给予卡托普利 10 mg/(kg·d),加生理盐水至4ml后灌胃。4周后大鼠逐渐出现呼吸、心跳加快,紫绀,皮下水肿症状,提示模型成功。6周后分别取10只大鼠作为研究对象。10周后,SH组、CAA组、CAP组各死亡10、8、8只,均以剩余大鼠作为研究对象。

1.4 Bax、Bcl-2的检测

切取心尖部组织0.3 g,放于120目不锈钢网上,将组织剪碎至1mm3大小,边揉搓边以PBS缓冲液冲洗。滤去细胞团块,收集细胞悬液离心保留沉淀,加入PBS缓冲液0.3 ml,稀释混匀后分成2份,调整每份细胞数为1×106cells/ml,用于检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白。分别取单细胞悬液1ml,分别加入0.1 ml工作液浓度的 Bcl-2、Bax单克隆抗体混匀,室温孵育30 min。加入PBS缓冲液10 ml混匀后离心弃上清。Bcl-2、Bax加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液0.1 ml,室温孵育30 min避光。加入10 ml PBS缓冲液混匀后离心弃上清。加入PBS缓冲液0.1 ml,经500目铜网过滤后使用流式细胞仪检测,结果用平均荧光强度表示。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠左心室内压上升、下降的最大变化速率比较

CAA组大鼠10周时收缩期左心室内压上升、下降的最大变化速率(±dp/dtmax)较6周时显著下降(P＜0.01),证实心衰大鼠心功能呈恶化趋势。CAP组大鼠10周时与6周时比较-dp/dtmax升高(P＜0.05),+dp/dtmax显著升高(P＜0.01)。提示随治疗时间延长,CAP组大鼠心功能得到进一步改善(表1)。

Tab.1 Comparison of±dp/dtmax in each group between 6week and 10 week(mmHg/s, ±s,n=30)

Tab.1 Comparison of±dp/dtmax in each group between 6week and 10 week(mmHg/s, ±s,n=30)

SH:Sham operation group;CAA:Coarctation of abdominal aorta group;CAP:Captopril intervention group;±dp/dt max:Rate of rise or descend of left ventricular pressure**P＜0.01 vs CAA 6 week group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs CAP 6 week group

Group week +dp/dtmax -dp/dtmax SH 6 3602.28±226.37 3138.74±226.12 10 3779.81±336.77 3146.02±273.37 CAA 6 1145.38±103.39 785.79±74.78 10 844.13±173.20** 671.08±38.40**CAP 6 2142.29±236.94 2019.92±157.42 10 2766.20±204.85## 2247.90±277.56#

2.2 各组大鼠心肌Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

6周及10周时CAA组较SH组Bcl-2蛋白表达显著下降(P＜0.01),Bax蛋白表达显著升高(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例显著下降(P＜0.01)。6周及10周时CAP组较CAA组Bcl-2蛋白表达显著升高(P＜0.01),Bax蛋白表达显著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例显著升高(P＜0.01,表2)。

2.3 10周Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比例与6周时比较

10周时SH组间心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达均无明显差异(P＞0.05)。CAA组较 6周时 Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例显著降低(P＜0.01)。CAP组较6周时 Bcl-2蛋白表达明显升高(P＜0.05),Bax蛋白表达显著降低(P＜0.01),Bcl-2/Bax比例显著升高(P＜0.01,表 2)。

Tab.2 Comparison of Bcl-2、Bax and Bcl-2/Bax in each group between 6 week and 10 week(±s,n=30)

Tab.2 Comparison of Bcl-2、Bax and Bcl-2/Bax in each group between 6 week and 10 week(±s,n=30)

SH:Sham operation group;CAA:Coarctation of abdominal aorta group;CAP:Captopril intervention group**P＜0.01 vs SH group;##P＜0.01 vs CAA group;△△P＜0.01 vs CAA 6 week group;▲P ＜0.05,▲▲P ＜0.01 vs CAP 6 week group

Group week Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax SH 6 460.80±17.87 330.97±20.79 1.40±0.14 10 473.70±21.32 339.29±9.21 1.40±0.05 CAA 6 390.97±20.71** 630.42±9.46** 0.62±0.04**10 348.89±19.63**△△ 659.83±32.81** 0.53±0.05**△△CAP 6 601.16±12.35## 504.22±27.77## 1.20±0.08##10 626.30±20.45##▲ 414.35±31.19##▲▲1.52±0.15##▲▲

3 讨论

缩窄腹主动脉导致慢性压力负荷造成大鼠肾脏缺血,导致肾素生成增加,儿茶酚胺增加,血压升高。缩窄腹主动脉可直接使血压升高,心脏后负荷加重,造成左心室肥厚导致左心衰竭。近年来有研究提示心肌细胞凋亡所致的心肌细胞减少是心力衰竭重要的发病学机制[4]。ACEI类药物卡托普利可降低血循环和心脏组织内的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的水平,抑制缓激肽分解、降低金属蛋白酶活性,抑制心肌纤维化和瘢痕形成,改善梗死心肌高能磷酸盐代谢。

在细胞凋亡过程中,Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡,而Bax蛋白则促进细胞凋亡。Bcl-2与Bax的比例决定细胞是否发生凋亡。高水平的Bcl-2/Bax有助细胞生存,过低则促进凋亡。本实验结果显示:模型组及治疗组大鼠心肌细胞中存在Bcl-2蛋白的表达,在CAA组Bcl-2蛋白表达较低,而Bax蛋白表达最高,Bcl-2/Bax比值最低,证实模型组大鼠心肌细胞凋亡最明显。在利用卡托普利治疗6周、10周后,Bcl-2蛋白表达较CAA组增多,Bax蛋白表达下降,Bcl-2/Bax比值升高,且10周治疗效果与6周比较具有统计学意义,证实卡托普利治疗后慢性压力负荷性心衰大鼠心肌细胞凋亡受到抑制,心功能改善。现在临床上应用ACEI类及ARB类药物改善心室重构的研究越来越普遍,动物实验表明,ARB可抑制心肌梗死大鼠的心肌肥厚和纤维化[5]。本实验结果进一步提示卡托普利对细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的影响,可能为其治疗心力衰竭的主要机制之一。

研究结果提示卡托普利能够抑制细胞凋亡,为我们在临床应用开辟了新的思路,对其机理的深入研究有助于探讨ACEⅠ类药物治疗心力衰竭的机制,进而为其在临床应用提供依据。

[1]Sabbah H N,Sharov V G,Goldstein S.Programmed cell death in the progression of heart failure[J].Ann Med,1998,30(Suppl 1):33-38.

[2]Kang PM,Izumo S.Apoptosis and heart failure:a critical review of the literature[J].Circ Res,2000,86(11):1107-1113.

[3]王艳飞,曹雪滨,崔英凯,等.改良大鼠左心室插管术及心衰大鼠左心功能指标的测定[J].中国比较医学杂志,2008,18(12):34-36.

[4] Elsässer A,Suzuki K,Schaper J.Unresolved issues regarding the role of apoptosis in the pathogenesis of ischemic injury and heart failure[J].J Mol Cell Cardiol,2000,32(5):711-724.

[5]孙 静,张世殊,毛用敏,等.西拉普利和缬沙坦对大鼠心肌梗死后心肌间质成分水平的干预研究[J].中国危重病急救医学,2007,19(4):244-245.