白藜芦醇对脂多糖激活小胶质细胞cdk5表达的影响*

李 爽,张 艳,姜洪波,杜爱林,徐春阳

(1.新乡医学院生理学教研室,2.免疫学教研室,3.三附院,河南新乡 453003)

小胶质细胞(microglia)在中枢神经系统分布较广,激活 后参与损伤、炎症、阿尔茨海默病等许多神经损伤过程,其损失机制尚未完全清楚。白藜芦醇(resveratrol,Res),是一类主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物,具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗高血脂症、抗脂质过氧化等多种活性,已经应用于多种疾病的防治。本实验通过观察白藜芦醇对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活小胶质细胞的影响及小胶质细胞中cdk5表达的变化,来探讨白藜芦醇神经保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

白藜芦醇、LPS、四氮唑盐复合物(XTT):美国Sigma公司;兔抗鼠cdk5多克隆抗体(北京博奥森),Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(碧云天)。

1.2 细胞培养

N9小胶质细胞由上海中科院惠赠,采用IMDM培养基常规培养,0.25%的胰酶消化传代,取对数期细胞进行实验。

1.3 XTT法检测细胞存活率

取对数生长期的N9细胞,以5×105cells/ml接种于96孔板内,100μ l/well,细胞贴壁培养 24 h后,加药处理。白藜芦醇剂量设置为5,10,20,40,80(μ mol/L)单独或与LPS(1 μ g/ml)共同作用,同时设空白对照。每个浓度设六个平行孔。细胞加药后继续培养48 h后,每孔加入50 μ l XTT/PMS混合液,置培养箱中37℃孵育2 h,酶标仪测定450 nm波长处吸光度值(A)。根据下列公式计算细胞平均存活率:存活率 =A药物处理组/A对照组×100%,实验重复3次。

1.4 细胞分组

白藜芦醇最终剂量根据XTT法确定(去除对细胞存活率有明显影响的白藜芦醇剂量)。对数期细胞以5×105cells/ml接种,分为对照组(不施加任何处理)、LPS 组(1 μ g/ml LPS刺激)、白藜芦醇低剂量+LPS组(5μ mol/L白藜芦醇+1 μ g/ml LPS共同作用)、白藜芦醇中剂量+LPS组(10 μ mol/L白藜芦醇+1 μ g/ml LPS共同作用)、白藜芦醇高剂量+LPS组(20 μ mol/L 白藜芦醇+1 μ g/ml LPS 共同作用)。

1.5 倒置相差显微镜观察小胶质细胞形态学改变

取对数生长期的N9细胞接种于24孔板内,贴壁培养24 h,加药处理48 h后,倒置相差显微镜下观察各组细胞形态变化,各组均取板孔正中视野进行观察。

1.6 小胶质细胞释放NO含量测定

Griess分析法测定细胞上清液中亚硝酸盐含量,代表NO含量。取对数生长期的N9细胞,以5×105cells/ml接种于96孔板内,100μ l/well,细胞贴壁培养24h,加药处理后继续培养48 h,取 上清 培养液 50 μ l,转移到 96 孔板,与 50 μ l的 Griess试剂室温下反应10 min,570 nm处测定其吸光度值,计算上清液中NO2-含量。

1.7 免疫荧光法检测cdk5蛋白表达

取对数生长期的N9细胞做细胞爬片,加药处理继续培养48 h后,用4%多聚甲醛固定15 min,3%BSA封闭20 min,加入兔抗鼠cdk5多克隆抗体(1∶100)4℃过夜,加入Alexa Fluor标记羊抗兔IgG(1∶500),室温孵育 2 h,抗荧光淬灭封片液封片;倒置荧光显微镜观察并拍照。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 白藜芦醇与LPS对小胶质细胞存活率的影响

本实验首先采用XTT法分析白藜芦醇和LPS在实验条件下对细胞存活率的直接影响,以排除药物的细胞毒性对模型的干扰。XTT法结果显示,1μ g/ml LPS作用于N9细胞,与对照组相比,对细胞存活率无明显影响;5～20μ mol/L浓度范围内的白藜芦醇,与对照组比,细胞存活率差别不显著(P＞0.05,表1)。提示此浓度范围内的白藜芦醇对小胶质细胞的毒性相对较低,可用于进一步的实验研究。因而以下试验均在此药物浓度范围内进行。

Tab.1 Effects of resveratrol and LPS on the cell survival rate of N9 microglia cells(%)

2.2 倒置相差显微镜观察小胶质细胞形态学改变

结果显示:LPS(1μ g/ml)处理细胞48 h,与对照组相比,细胞由阿米巴样或圆形转变为扁平状、多极杆状,细胞变得肥大,突起伸长。而中高浓度白藜芦醇(10,20 μ mol/L)与LPS共同作用,对细胞活化形态有明显影响,细胞形态基本恢复到与对照组相同。

2.3 小胶质细胞释放NO含量

结果显示:不同浓度白藜芦醇(5,10,20 μ mol/L)单独作用于小胶质细胞,对于NO释放没有明显影响(表2)。中高浓度白藜芦醇(10,20 μ mol/L)作用于 LPS激活的小胶质细胞,可显著抑制LPS激活的小胶质细胞释放NO(P＜0.01,表3)。

Tab.2 Effects of resveratrol on NO released into the supernatant in N9 cells(μ mol/L)

Tab.3 Effects of resveratrol on NO released into the supernatant in LPS-activated N9 cells(μ mol/L)

2.4 小胶质细胞 cdk5蛋白表达

cdk5蛋白在正常N9细胞低表达,阳性细胞胞质呈绿色(图1A);LPS激活后,N9细胞高表达 cdk5蛋白,荧光强度增加,且细胞处于活化形态(图1B);低浓度白藜芦醇(5 μ mol/L)与LPS共同作用,对cdk5蛋白表达无明显影响(图 1C);中高浓度白藜芦醇(10,20 μ mol/L)与LPS共同作用,可以明显下调cdk5蛋白表达,且细胞形态基本恢复(图1D、E,图 1见彩图页Ⅱ)。

3 讨论

N9小胶质细胞株是来源于小鼠的细胞株,其表型与未活化状态下小鼠小胶质细胞一致,可很好模拟原代小胶质细胞的特性,该细胞株被广泛应用于研究小胶质细胞的实验模型。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性杆菌胞壁外膜层的重要组分,在体内和体外研究中被广泛地用于激活小胶质细胞。

白藜芦醇(resveratrol,Res)是存在于虎杖等植物中的一种多酚类化合物,具有多方面药理活性。早已有研究者报道白藜芦醇具有神经保护作用,但其作用机制尚未明确[1]。本实验结果表明,LPS作用48 h后,小胶质细胞形态发生明显改变,呈现典型的激活形态,与之前的结果一致[2]。Res与LPS共同作用,能够明显抑制细胞形态的改变,证明其具有抑制小胶质细胞活化的作用。

小胶质细胞过度激活能够产生NO,而中枢神经系统中过量的NO可通过氧化应激、损伤膜性结构等,导致神经元坏死或凋亡[3]。有研究认为白藜芦醇能强烈抑制脂多糖激活的巨噬细胞生成NOS,明显减低细胞胞浆内iNOS蛋白和mRNA的水平[4]。本实验结果表明,Res与LPS共同作用,能够明显抑制小胶质细胞活化所释放的NO。提示白藜芦醇的神经保护作用可能与抑制小胶质细胞生成iNOS,减少NO释放有关。

脑组织中细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5,cdk5)属于细胞周期素依赖性蛋白激酶(cdks)家族。已有实验证实,cdk5抑制剂有神经保护作用。而cdk抑制剂也能抑制小胶质细胞激活。据此,本实验检测了小胶质细胞上cdk5表达情况。结果表明,LPS刺激小胶质细胞会导致cdk5表达水平上升;而Res与LPS共同作用,则会显著下调cdk5表达。这提示我们,Res抑制小胶质细胞活化的作用可能与cdk5相关。然而其分子机制和途径仍不明确。早有研究显示脑组织中cdk5的活性受[Ca2+]i调节,当[Ca2+]i升高时cdk5的活性增加[5]。另有研究表明,Res能抑制大鼠海马L-钙通道,减少[Ca2+]i[6]。有关 Res是否通过下调[Ca2+]i表达而减少cdk5,进而抑制小胶质细胞活化起到保护作用,值得进一步研究。

[1]任俊伟,杨 琴.白藜芦醇对脑缺血/再灌注氧化应激损伤保护机制的研究进展[J].中国药理学通报,2011,27(4):448-451.

[2]白群华,李文明,刘洪涛,等.葛根素对脂多糖诱导N9小胶质细胞激活的抑制作用[J].细胞与分子免疫学杂志,2010,26(3):227-230.

[3]Choy C S,Hu C M,Chiu W T,et al.Suppression of lipopolysaccharide-induced of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 by Sanguis Draconis,a dragon's blood resin,in RAW 264.7 cells[J].J Ethnopharmacol,2008,115(3):455-462.

[4]Kim Y A,KimG Y,Park K Y,et al.Resveratrolinhibits nitric oxide and prostaglandin E2 production by lipopolysaccharide-activated C6 microglia[J].J Med Food,2007,10(2):218-224.

[5]Lee M S,Kwon Y T,Li M,et al.Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain[J].Nature,2000,405(6784):360-364.

[6]Li M,Wang Q S,Chen Y,et al.Resveratrol inhibits neuronal discharges in rat hippocampalCA1 area[J].ActaPhysiologica Sinica,2005,57(3):355-360.