缺血后处理降低高胆固醇血症大鼠心肌对缺血/再灌注损伤的易感性及其机制*

赵焕新,李晓宇,武 烨,王晓木梁,赵荣瑞,刘慧荣

(1.山西中医学院生理教研室,太原 030024;2.山西医科大学,太原 030001;3.首都医科大学生理学与病理学系,北京 100069)

缺血性心脏病严重危害着人类健康,目前临床对于缺血性心脏病的治疗主要采取解痉、溶栓等方法以尽早恢复缺血区的血液再灌,但是再灌注本身会引起细胞发生额外损伤即再灌注损伤。已有研究证实[1],缺血后处理(ischemic postconditioning,PostC)能够明显减轻缺血/再灌注导致的心肌损伤。但是在临床上,冠脉梗塞所致的心肌缺血多发生于老年人,且常常伴有高胆固醇血症(hypercholesteremia,HC),而高胆固醇血症会明显加重缺血/再灌注造成的心肌损伤。关于缺血后处理能否同样减轻高胆固醇血症基础发生的心肌缺血/再灌注损伤及其可能的机制,目前研究尚不明确。因此,本研究通过建立食源性高胆固醇血症但不发生动脉粥样硬化的大鼠模型,旨在探讨缺血后处理对高胆固醇血症基础上发生的心肌缺血/再灌注损伤的影响,以及低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

Even's blue和 TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑):Sigma;肌酸激酶(creatine kinase,CK)检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;血清甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)检测试剂盒:中生北控生物科技股份有限公司;caspase-3活性检测试剂盒:BIOMOL,USA;HIF-1α兔多克隆抗体、β-Actin兔多克隆抗体:Santa Cruz

1.2 模型建立

1.2.1 高胆固醇血症大鼠模型建立 健康雄性Wistar大鼠60只,体重(120±10)g,分为两组(n=30):普通饮食组(普通饲料喂养8周),高脂饮食组(高脂饲料[2]喂养8周)。定期称量大鼠体重,于8周时鼠尾采血测定血脂水平。成模标准:以TC、TG、LDL水平与正常饮食组相比显著升高(P＜0.05)为成模标准。

1.2.2 大鼠心肌缺血/再灌注和缺血后处理模型建立 喂养 8周后的大鼠,参照本实验室常规方法[2,3],结扎大鼠冠状动脉左前降支造成左心室缺血,以心电图出现ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功标准。结扎30 min(即缺血30 min)后,松开结扎线恢复冠脉血液灌注并持续(即再灌注)3 h。结扎冠状动脉左前降支缺血30 min后,松开结扎线10 s,再次结扎进行缺血10 s,依此重复三次,然后持续再灌3 h(即缺血后处理)。

1.3 实验分组

实验共分6组(n=10):(1)正常饮食-伪手术组(N-sham,):仅在冠状动脉左前降支(LAD)下穿线,不结扎,持续 210 min;(2)正常饮食-缺血/再灌注组(N-I/R):缺血30 min,再灌注3 h;(3)正常饮食-缺血后处理组(N-PostC):结扎LAD 30 min,随即进行10 s再灌注+10 s缺血,重复3次,随后再进行3 h再灌注;(4)高胆固醇血症-伪手术组(HC-sham):手术操作同(1);(5)高胆固醇血症-缺血/再灌注组(HC-I/R):手术操作同(2);(6)高胆固醇血症-缺血后处理组(HC-PostC):手术操作同(3)。

1.4 指标测定

1.4.1 心梗面积测定 参考本实验室常规方法[2,3],于再灌注结束后再次结扎LAD,经股静脉注入2%Even's blue后快速取出心脏,将左心室垂直于心腔纵轴方向自心底向心尖平均切成六片环形的薄片,在37℃于 1%TTC中避光孵育15min,用10%福尔马林固定。正常的心肌组织被染成蓝色,缺血区的心肌组织被染为红色,梗死的心肌组织为白色。用扫描仪对心脏切面进行扫描,利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分别测定蓝色、红色和白色区域面积。缺血区面积(AAR/LV,%)=(缺血区总面积/左心室面积)×100%;心梗面积(An/AAR,%)=(梗死区面积/缺血区总面积)×100%

1.4.2 血清CK活性的测定 实验结束后经腹主动脉取血,室温静置30 min,1 000 r/min离心15 min,取血清,采用南京建成生物工程研究所的CK检测试剂盒进行测定。

1.4.3 心肌组织caspase-3相对活性的测定 心肌组织充分裂解后于4℃、10 000×g离心10 min,取50 μ l上清与底物于37℃孵育1.5 h,酶标仪检测其光密度(OD)值。用蛋白含量标准化校正OD值,以sham组的活性为1,计算其余各组的相对活性(比活性)。

1.4.4 实时定量PCR法测定心肌组织HIF-1αmRNA的表达 再灌注结束后取缺血区心肌组织约50 mg,参照文献方法提取总 RNA、每个样品取3 μ g总RNA进行反转录后,于Mx3005实时定量PCRSystem上进行扩增 ,选用 β-actin 作为对照 。 采用 2-ΔΔCt法对HIF-1α mRNA进行相对定量计算。

1.4.5 Western-blot方法检测心肌组织HIF-1α的蛋白水平 再灌注结束后取缺血区心肌组织约50mg,参照文献方法,反应结束后经DAB显色,扫描目的条带,采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行积分光密度(IOD)测量分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 高脂饮食喂养8周后大鼠血脂水平明显增加

如表1所示,给予高脂饲料前,60只大鼠的血脂水平无明显差异,其中30只经高脂饮食喂养后,血脂水平较8周前显著提高,其血清中TC、TG及LDL水平显著高于同期普通饮食喂养的大鼠血脂水平(P＜0.01),表明高脂模型建立成功。

2.2 高胆固醇血症增加了心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性

心肌缺血/再灌注后,正常饮食大鼠心肌梗死面积(梗死区面积/缺血区总面积,An/AAR,图1A)为33.4%±1.4%,而高胆固醇血症大鼠心肌梗死面积达39.5%±1.2%,高胆固醇血症使缺血/再灌注造成的心梗面积略有所增加。此外,与正常饮食大鼠相比,高胆固醇血症使缺血/再灌注大鼠血清CK活性进一步增加(高胆固醇血症组0.56±0.06 U/mlvs正常饮食组0.47±0.04 U/ml,P＜0.01,图1B)。与上述结果一致,缺血/再灌注导致的高胆固醇血症大鼠心肌caspase-3活性(4.63±0.42)比正常饮食大鼠caspase-3活性(2.31±0.27,P＜0.01,图1C)增加更加显著。

以上结果提示,高胆固醇血症增加了心肌对缺血/再灌注损伤的敏感性。

Tab.1 Plasma lipid level of baseline and after fed for 8 weeks(mmol/L,±s,n=30)

Tab.1 Plasma lipid level of baseline and after fed for 8 weeks(mmol/L,±s,n=30)

TC:Total cholesterol;TG:Triglyceride;LDL:Low density lipoprotein**P＜0.01 vs normal diet group

Group Baseline After fed for 8weeks TC TG LDL TC TG LDL Normal diet group 2.82±0.50 0.64±0.15 0.88±0.19 2.70±0.96 1.01±0.08 1.00±0.19 High fat diet group 2.92±0.47 0.64±0.21 0.90±0.16 4.10±0.61** 1.36±0.39** 1.73±0.57**

2.3 缺血后处理显著减轻了高胆固醇血症大鼠缺血/再灌注所致的心肌损伤

如图1A所示,在正常饮食组和高胆固醇血症组,缺血后处理均可缩小缺血/再灌注导致的心肌梗死面积(正常饮食组:24.8%±1.8%vs33.4%±1.4%,P＜0.05;高胆固醇血症组:29.7%±3.5%vs39.5%±1.2%,P＜0.01),降低血清CK活性(图1B)及心肌组织 caspase-3活性(图 1C),且两组减小程度均无明显差异。以上结果提示,不论是正常组或高胆固醇血症组,缺血后处理都可以有效减轻缺血/再灌注造成的心肌损伤。

2.4 缺血后处理提高了高胆固醇血症大鼠缺血/再灌注心肌组织HIF-1α的蛋白水平

Western-blot方法检测缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α的蛋白表达水平的结果显示,缺血/再灌注使高胆固醇血症大鼠心肌组织中HIF-1α的蛋白含量明显增加,达到伪手术组的1.81倍;而给予缺血后处理后,HIF-1α的蛋白水平进一步提高,为伪手术组的3.02倍(P＜0.01,图2)。结果提示,心脏经过长时间缺血之后,缺血后处理仍然可以触发HIF-1α蛋白的表达。用实时定量RT-PCR方法检测各组大鼠心肌组织HIF-1α mRNA的表达,结果表明,心肌组织中HIF-1α mRNA水平在各组大鼠间无明显差异。

2.5 心肌组织HIF-1α蛋白水平与心梗面积之间的相关性分析

我们对高胆固醇血症大鼠心肌组织HIF-1α的蛋白表达水平与作为反映心肌缺血/再灌注损伤的金指标---心梗面积之间作了相关性分析,结果显示,HIF-1α的蛋白水平与心梗面积呈显著负相关(r=-0.802,P＜0.01,图3)。

3 讨论

高胆固醇血症是缺血性心脏病发生发展过程中最主要的一个危险因素。流行病学研究显示,血清总胆固醇浓度升高与心肌梗死的发病率和死亡率之间存在着显著的相关性。Osipov等[4]对高胆固醇饮食喂养16-20周的猪进行缺血/再灌注的研究发现,高胆固醇血症显著加重了缺血/再灌注所致的心肌梗死和心肌细胞凋亡。本研究在食源性高胆固醇血症大鼠模型中也观察到,高胆固醇血症使缺血/再灌注造成的心肌梗死面积进一步扩大,血清CK活性及心肌细胞凋亡明显增加,这些结果均说明高胆固醇血症增加了心肌组织对缺血/再灌注损伤的易感性。

2003年Zhao等[1]在对犬进行心肌缺血/再灌注的研究中首次提出了“缺血后处理”(ischemic postconditioning,PostC)的概念,发现缺血后处理可以明显减轻再灌注造成的心肌损伤。目前,缺血后处理的效应已经在动物模型[5]和临床观察[6]中得到证实。但是值得注意的是,目前对缺血后处理减轻再灌注损伤的实验研究大都是采用健康动物作为模型,而缺血后处理对于伴发高胆固醇血症的心肌缺血/再灌注损伤是否同样具有保护效应,还存在争议。Martin等[7]在对高脂饮食喂养的兔进行心脏离体灌流时观察到,缺血后处理通过激活A1受体和KATP通道可以减小心肌梗死面积;而Iliodromitis[8]等则在高胆固醇血症伴动脉粥样硬化的兔模型上发现缺血后处理并不能改善缺血/再灌注造成的心肌梗死。类似的研究大多是利用兔建立高胆固醇血症模型后对心脏进行离体灌流,而且在研究时该模型高胆固醇血症基本上已发展为不同程度的动脉粥样硬化。因此这些研究结果提示,动脉粥样硬化的不同进程可能影响了对缺血后处理效应的研究。为此,我们在研究中利用大鼠建立了食源性高胆固醇血症但不发生动脉粥样硬化的模型[9],结果发现缺血后处理同样可以缩小高胆固醇血症大鼠缺血/再灌注所致的心肌梗死面积、减少心肌细胞凋亡。

Fig.1 Effects of ischemia/reperfusion and ischemic postconditioning onmyocardial injury in both normal and hypercholesteremic rats

缺血后处理的心肌保护机制可能涉及多种因素、多条途径共同参与,但是在众多机制中究竟哪一种因素起始发、主导作用还不清楚。有研究表明[10],HIF-1α作为氧平衡调节中起关键作用的转录因子,其表达增加可能是心肌缺血/再灌注过程中最早期的分子水平上的适应性反应,可以增强心肌对抗缺血/再灌注损伤的能力。在本研究中我们检测了高胆固醇血症大鼠缺血后处理心肌组织中HIF-1α的蛋白水平,结果发现缺血后处理进一步上调了HIF-1α的蛋白表达水平,而且随着HIF-1α蛋白水平增加,缺血/再灌注造成的心肌梗死面积明显减小,二者之间呈现显著负相关。这一结果提示,HIF-1α可能是缺血后处理减轻高胆固醇血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制之一。

Fig.2 Effect of ischemic postconditioning on the expression of HIF-1αprotein level in hypercholesteremic rats

Fig.3 Linear analysis between infarct size(An/AAR)and HIF-1αprotein expression

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