多基因SNP位点及多种危险因素与老年汉族冠心病的关联分析*

孙玉发,曹 剑,李晓利,,范 利△,王 强,王 卉,张 红,杨 莉,张 帆

(1.解放军总医院南楼心血管一科,北京 100853;2.解放军第309医院干部病房;3.国防大学第一干休所;4.八一队干休所,北京 100091)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)在老年人群中高发,是老年疾病的一种。由于受到社会经济水平、生活方式以及老龄化进程加速的影响,冠心病迅速成为中国老年人群的主要疾病以及主要死亡原因,同时与冠心病相关的危险因素较50年代发生了明显变迁。CHD确切的病因并未完全阐明。遗传易感性与危险因素交互作用是CHD发病的主要机制。CHD归属于多基因遗传疾病,因此采用高通量基因学或全基因组学方法研究CHD遗传易感性必将成为研究CHD基因学的趋势[1]。多基因遗传疾病的特点在于多种微效基因存在累加效应。推测多种微效基因的改变,导致某些与CHD病因相关分子的结构以及数量改变,使得与危险因素包括可控制因素(比如高血压、吸烟、高脂血症、生活方式等)与不可控制因素(年龄、性别、CHD家族史等)的交互作用模式发生改变,从而导致CHD的发生与发展。

基于以上的认识,我们研究了影响CHD发生的15种常见危险因素以及10种易感基因。借助新型高通量的基因多态性分型研究技术,采用候选基因方法,筛选了10种与已有报道与老年疾病比如与糖尿病、冠心病、高血压、老年性痴呆、高脂血症、动脉血栓及栓塞等疾病相关的基因,包括:血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE),血小板糖蛋白(glycoprotein Iba,GPIba),亚甲基四氢叶酸还原酶(mthylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR),血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),微管相关蛋白tau(microtubule-associated protein tau,MAPT),血小板糖蛋白6(platelet glycoprotein 6,GP6),纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1 gene),环氧化酶(cycloxygenase-1,COX-1),血小板ADP受体(purinergic receptor P2Y1,P2Y1),抗凝血酶(antithrombin III,ATIII),共10种基因11单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与CHD关联性进行了分析。

1 材料及方法

1.1 研究方法

采用病例-对照研究方法。

1.2 研究对象

人群来自于2008年4月～2010年7月解放军总医院、解放军309医院、海军总医院以及25个军队干休所共246例老年汉族冠心病汉族患者,同时入选老年非冠心病患者185例作为对照组。符合其中一项诊断为冠心病:(1)慢性稳定型心绞痛患者;(2)陈旧性心肌梗死患者;(3)经皮冠状动脉介入术后患者或外科冠状动脉搭桥(CABG)术后患者;(4)年龄≥65岁的汉族人群。排除标准:不能配合调查,不愿参加调查者。本研究通过中国人民解放军总医院科学和伦理审查委员会批准;所有病人提供书面知情同意后方可入选。

1.3 问卷调查

主要内容包括:年龄、性别、民族、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症等。

1.4 血样标本采集

抽取大约10 ml静脉血。检测指标包括:同型半胱氨酸,氨基末端脑钠肽前体,超敏C反应蛋白,抗凝血酶III,胆固醇,甘油三酯,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白等。

1.5 DNA提取和SNP检测

DNA提取采用传统采用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)方法。利用Sequenom系统利用激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行SNP基因分型。设计3条引物,2条用于PCR,用于目的基因延伸,1条引物(探针)用于单碱基延伸,针对SNP突变位点,突变位点检测是通过质谱仪对分子质量的不同进行检测,利用特定软件,设计不同分子质量的引物探针,不同的SNP位点在质谱图上会形成不同的峰,彼此之间无重叠,从而根据分子质量之间的差异,完成多重SNP检测。具体根据SNP位点序列,采用Sequenom公司的Assay Design 3.1软件进行引物设计。引物情况见表1。SNP_ID为SNP序列号;1st-PCRP和2nd-PCRP为PCR扩增引物,DIR为扩增方向,F指PCR扩增的为SNP位点,R指PCR扩增的为SNP位点互补链,对标识R的SNP,在结果分析时需要置换成SNP位点对应位点碱基。Mass为探针分子质量;probe为单碱基延伸引物(探针)。SNP检测采用美国Sequenom系统SNP分型技术,具体见Sequenom系统SNP分型技术操作手册。扩增效率大于75%的样本,纳入统计学分析。

1.6 统计分析

SPSS 13.0完成统计学分析。计数资料采用χ2检验,正态分布计量资料采用成组t检验,资料描述采用平均数加标准差(±s),偏态计量资料采用秩和检验方法检验,资料描述采用中位数M,变异范围用5%分位数到95%分位数(P5-P95)描述。冠心病危险因素筛查分析是将单因素检验P＜0.01的参数,纳入多因素非条件性Logistic回归法。SNP位点等分析采用:(1)应用haploview 4.2软件对总体样本进行哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg,H-W)分析;(2)应用THESIS软件对病例对照组基因型频率进行χ 2关联分析;(3)在基因型/频率关联分析基础上,阳性结果应用在线软件SNPstats进行非条件Logistic回归模型评估基因型与CHD发生风险相关程度,并计算优势比(OR)及95%可信区间(CI)。

Tab.1 Primers and probes in 11 SNPs of 10 genes

2 结果

2.1 人口学特征与危险因素分析

表2所示共计调查了431例老年汉族患者,冠心病246例,非冠心病185例,冠心病占总数57.08%。单因素分析冠心病患者与非冠心病患者相比,性别、吸烟、饮酒、糖尿病、高脂血症、同型半胱氨酸、超敏C反应蛋白、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白,统计学无明显差异(P＞0.05)。但年龄、高血压、抗凝血酶III、氨基末端脑钠肽前体、低密度脂蛋白,在冠心病与非冠心病患者中存在统计学差异(P＜0.05)。将单因素分析P＜0.10的参数包括:年龄、高血压、高脂血症、氨基末端脑钠肽前体、抗凝血酶III、胆固醇、低密度脂蛋白纳入非条件Logistic回归二次分析。结果显示增龄、高血压为冠心病危险因素,P值分别是0.00,0.05和0.02,95%CI分别为(1.01,1.05),(1.05,2.84)和(1.08,2.74),ATIII为冠心病保护因素,ATIII在非CHD患者中高表达(107.02%±14.09%vs103.27%±13.91%),P值为0.00,CI为(0.96,0.99)(表3)。

2.2 SNP与冠心病关联分析

haploview 4.2对10个基因11个SNPs位点进行HW平衡检验,所有位点符合HW平衡,所有位点扩增效率大于75%,全部纳入SNP与冠心病相关分析。应用THESIS软件对病例对照组基因型频率进行χ2关联分析结果提示GP1BA rs6065(524C/T),MTHFR rs1801133(677C/T),HO-1 rs2071746(-413A/T),MAPT rs242557(A/G),ACE rs4332(547C/T),GP6 rs1613662(13254T/C),PAI-1 rs2227631(-844 G/A),COX-1rs1330344(1676C/T)和P2RY1 rs1065776(893C/T)与冠心病无明确相关(表4)。而GP1BA rs2243093(-5T/C)与冠心病呈现相关趋势,P=0.06接近0.05,CC基因型是冠心病发生危险因素,OR=2.83 CI=(1.03,7.76)。ACE rs4332(547C/T)与冠心病明确相关,P=0.01。野生型CC为CHD危险因素,OR=1.55 CI=(1.04,2.31);ATIII rs2227589(893C/T)与CHD相关,P=0.01,CC野生型为CHD保护因素,OR=0.56,CI=(0.38,0.82)。

3个阳性位点GP1BA rs2243093(-5T/C),ACE rs4332(547C/T),ATIII rs2227589(893C/T)应用在线软件SNPstats进行非条件Logistic回归模型评估与CHD相关性(表5)。结果显示:GP1BA rs2243093(-5T/C),与TT+CT基因型相比,突变CC基因型是CHD发生危险因素,P=0.029,OR=2.83,CI=(1.03,7.76),经年龄、高血压,高脂血症、ATIII三个冠心病危险因素校正后,突变CC基因型是CHD的危险因素,P=0.014;ACE rs4332(547C/T),杂合型TC基因型是CHD的保护因素,P=0.003,OR=0.51,CI=(0.34～0.77),纯合子TT和CC是CHD的危险因素。经年龄、高血压,ATIII三个CHD危险因素校正后,P=0.001,OR=0.51,CI=(0.34～0.77)。ATIII rs2227589(893C/T),突变基因T携带者CT+TT基因型是CHD的危险因素,P=0.003,OR=1.79,CI=(1.22～2.63),经年龄、高血压、高脂血症、ATIII校正后,P=0.006,OR=1.76,CI=(1.17～2.63)。

Tab.2 Demographic details for the patients

Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of clinical risk factors with CHD

Tab.4 Correlation analysis of 11SNPs of 10-plex genes with CHD

Tab.5 Correlation analysis of SNPs of GP1BA,ACE,ATIII with CHD by logistic regression

3 讨论

尽管CHD发病具有普遍性,但是,受到不同地域、不同人种、性别、年龄,不同生活方式等的影响,CHD发病有其自身的特点。文献陆续报道的CHD危险因素已有300多个,包括了性别、年龄、吸烟、家族史、血脂异常、高血压、糖尿病、凝血和纤溶功能异常,感染和炎症反应、氧化应激,同型半胱氨酸等,但年龄、高血压、高脂血症仍旧是CHD共同的危险因素[2]。动脉粥样硬化是CHD发病的病理基础,动脉粥样硬化起自少儿期,30～49岁冠状动脉粥样硬化急剧进展,中老年之后逐渐出现CHD的症状。在我们的研究当中,显示增龄、高血压、是中国老年汉族患者CHD发病的危险因素,而吸烟、肥胖、糖尿病不是构成中国老年汉族患者CHD的主要环境危险因素。

CHD是一种多基因遗传疾病,CHD关联基因对CHD风险预测作用不亚于传统的危险因素,CHD关联基因的揭示发挥着推动 CHD个性化治疗的作用[3]。推测大约有500个基因参与了冠心病的发生发展[4]。CHD遗传易感性存在人种的差异性。某些CHD易感位点可能在高频出现某一人种,从而构成主要的致病基因。单一致病基因对CHD贡献不大,多种致病基因累积是CHD发病的遗传学基础。因此,研究中国人群CHD遗传易感性,必须首先明了对CHD哪些基因及易感位点对中国人群CHD构成危害。10种基因11SNP与CHD关联分析研究结果提示,中国老年患者存在CHD三种易感性基因以及对应的3个SNPs位点,分别是GPIba(rs2243093),ACE(rs4332)和ATIII(rs2227589)。而已有报道与CHD相关的基因或位点GPIbars6065,GP6 rs1613662,HO-1 rs2071746,MTHFR rs1801133,PAI-1 rs2227631却与中国老年CHD无关联。COX-1和P2RY1与参与阿司匹林抗血小板作用,本研究中未发现 MAPT、COX-1和 P2RY1 SNP位点 rs7831,rs242557,rs1330344和rs1065776 CHD关联。

血小板糖蛋白Iba(glycoprotein Iba,GPIbα)是血小板表面vWF因子受体亚单位,GP Iba-Ibβ-IX-V共同构建成vWF因子受体,该受体复合物与vWF结合位点位于GP IbaN-端结构域,vWF因子-GP Ib/IX/V交联参与动脉血栓性疾病形成[5],GPIba rs2243093(-5T/C),T/C多态性位于启动子区kozak序列,有报道C等位基因携带者,血小板GPIb-IX-V在体外和体内受体表达增加。我们的研究结果显示了GPIba rs2243093(-5T/C)与CHD相关。而另一个GPIba rs 6065(2217C/T)引起位于vWF受体结合域第145位苏氨酸/蛋氨酸(Thr/Met)改变,同样有报道rs 6065(524C/T)与动脉血栓性疾病相关联,我们的结果不支持GPIbαrs 6065与CHD相关联。

抗凝血酶III(antithrombin,ATIII)反映机体抗凝血的功能。CHD患者存在不同程度的高凝状态。1991年,俄国Koshkin IuP等研究发现具有CHD家族史的患者,发现抗凝血酶III活动度可以作为一个CHD遗传易感性的一个标志。我们研究结果显示:无论从蛋白水平以及从基因水平上,ATIII与 国人CHD相关联。在蛋白水平上,ATIII在非CHD人群中呈现高表达(107.02%±14.09%),在CHD中呈现低表达(103.27%±13.91%)。在基因水平上,发现ATIII rs2227589(893C/T)与国人CHD相关联。纯合子野生型CC基因型是CHD保护因素,在非CHD患者中出现频率为58.92%,在CHD患者中出现频率为44.49%。除外同动脉血栓关联之外,另外有报道ATIII rs2227589(893C/T)突变引起抗凝血酶活性减低与深静脉血栓形成相关联[6]。

血管紧张素转化酶(angiotensin-convertion enzyme,ACE)ACE插入/缺失性(I/D)多态性基因多态性与CHD相关联,报道颇多。D突变体携带者,ACE表达上调[7],肾素-血管紧张素-醛固酮轴活性增加,包括动脉硬化、心肌梗死、阿尔茨海默病等风险增加。我们在研究中发现另一个ACE基因多态性位点rs4332(547C/T)与CHD相关联。rs4332位于内含子区域,杂合型CT基因型是冠心病的保护因素,而CC+TT基因型则是CHD危险因素。推测位于内含子区域的突变位点不影响ACE分子结构,可能通过影响基因剪切、拼接,从而影响ACE转录效率,其作用机理,有待于进一步深入探索。

本研究初步探索老年CHD患者发病的部分环境危险因素和遗传学基础,结果证明了增龄、高血压、抗凝血酶III下降是影响老年冠心病的主要危险因素。同时证明了血小板、抗凝血系统、肾素-血管紧张素系统三种机制参与了老年冠心病的发生与发展,为老年CHD的临床干预提供了一定的流行病学及遗传学依据。

[1]SamaniN J,ErdmannJ,HallA S,et al.Genomewide association analysis of coronary artery disease[J].N Engl J Med,2007,357(5):443-453.

[2]Meadows T A,Bhatt D L,Cannon CP,et al.Ethnic Differences in Cardiovascular Risks and mortality in atherothrom-botic disease:insights from the reduction of atherothrombosis for continued health(REACH)registry[J].Mayo Clin Proc,2011,86(10):960-967.

[3]The Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention(EGAPP)Working Group.Recommendations from the EGAPP Working Group:genomic profiling to assess cardiovascular risk to improve cardiovascular health[J].Genet Med,2010,12(12):839-843.

[4]Winkelmann B R,Hager J,Kraus W E,et al.Genetics of coronary heart disease:current knowledge and research principles[J].Am Heart J,2000,140(4):S11-26.

[5]DouglasH,MichaelidesK,Gorog D A,et al.Plateletmembrane glycoprotein Ibalpha gene-5T/C Kozak sequence polymorphism as an independent risk factor for the occurrence of coronary thrombosis[J].Heart,2002,87(1):70-74.

[6] Antón A I,Teruel R,Corral J,et al.Functional consequences of the prothrombotic SERPINC1 rs2227589 polymorphism on antithrombin levels[J].Haematologica,2009,94(4):589-592.

[7]Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al.Evidence,from combined segregation and linkage analysis,that a variant of the angiotensin I-converting enzyme(ACE)gene controls plasma ACE levels[J].Am J Hum Genet,1992,51(1):197-205.