骨骼肌和心肌缺血后处理对兔缺血/再灌注心肌的保护作用*

曹广运,谢瑞芹,崔 炜,刘 凡,刘 静,鲁静朝,任慧敏,呼海娟

(河北医科大学第二医院心内科,石家庄 055550)

冠心病是影响人们身体健康的重要疾病,其中急性心肌梗死是危及人们身体健康的重要原因之一。在急性心肌梗死病人中,无论是药物溶栓还是经皮冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)或冠脉搭桥,及时有效恢复灌注是挽救心肌的重要治疗措施。然而再灌注治疗却不可避免的引起缺血/再灌注损伤。因此,如何减少心肌的缺血/再灌注损伤是目前研究的热点。

近年来,人们对减少心肌缺血/再灌注损伤的方法进行了深入的研究,发现缺血预适应和后适应均是减少心肌缺血/再灌注损伤的有效方法,而缺血后适应因其实用性和可操作性逐渐被学者所关注。

缺血后适应又称为缺血后处理,其包括心肌本身的缺血后适应和其它器官对心肌的缺血后适应,也称为远端缺血后适应,如肾脏、小肠等的缺血后处理都可减少心肌的缺血/再灌注损伤[1]。在远端器官中,骨骼肌以其对缺血的耐受性强和操作方便有可能成为心脏保护的首选器官。但骨骼肌缺血后处理和心肌的缺血后处理对心脏保护作用是否存在差异,以及两者联合后心脏保护作用是否可以叠加目前研究较少。本实验预对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康新西兰大白兔30只,雌雄不拘,体重2.5～3.0 kg。所有动物随机分为5组(n=6):缺血对照组(Con)、假手术组(sham)、心肌缺血后处理组(myocardial ischemic postconditioning,MPostC)和肢体缺血后处理组(remote postconditioning,RPostC)及心肌缺血后处理联合肢体缺血后处理组(MPostC+RPostC)。

1.2 模型制备

1.2.1 心肌缺血/再灌注模型制备 兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后固定于实验台上,气管插管,连接小型动物呼吸机,以1 L/min的速度给予富含100%氧气的气体。心电图机针形电极插于动物四肢皮下,分离左颈总动脉插管连接压力换能器监测血压(BP)和心率(HR)。游离右颈总静脉及双侧髂外动脉备用。

小止血钳夹断3、4肋软骨,钝性分离,钳夹肋间内、外肌止血。上、下缘游离出2.5 cm左右的纵行切口,剪开纵隔胸膜,露出心包,暴露心脏。并游离颈动脉备用。找出左冠状动脉的旋支及左室支。眼科5-0针线缝扎左室支中点处(以左心耳到心尖连线的中点平面),以内径0.5 cm的硅胶管套线,束紧后紧贴硅胶管的上端用止血钳夹紧线观察:(1)心肌的颜色变化:由红色变暗灰色。(2)结扎前、后心电图改变 :Ⅱ、Ⅲ、aVF导联ST段抬高,为心肌缺血成功。松开套管后心肌颜色迅速恢复为原来红色为心肌再灌注成功。

1.2.2 骨骼肌缺血/再灌注模型 采用2%利多卡因局麻双侧腹股沟区,直视下分离双侧髂外动脉,动脉夹钳夹固定部位阻断远端血流,通过结扎远端动脉搏动的有无反映下肢血流的阻断情况。

1.3 分组处理

缺血/再灌注模型制作成功,血流动力学稳定10 min后按以下程序分组进行干预。(1)缺血对照组(Con):按如上步骤致使兔心肌持续缺血45 min,然后再灌注120 min。(2)假手术组(Sham):麻醉,暴露心脏,分离左室支,穿线但不接扎。(3)近端后处理组(MPostC):在心肌缺血末再灌注开始时,对结扎的左室支给予开通20 s-闭塞20 s,即R/I循环3次,后再灌注至 120 min。(4)远端后处理组(RPostC):分离双侧髂外动脉,在心肌缺血末再灌注开始前12 min,用动脉夹夹闭双侧髂外动脉,行缺血5 min-开通1 min,即I/R循环2次,并于心肌再灌注时同时松开双侧髂外动脉,与心肌同时灌注至120 min。(5)近端后处理+远端后处理组(MPostC+RPostC):心肌缺血45 min后分离双侧髂外动脉,在缺血末再灌注开始前12 min夹闭,行缺血5 min-开通1 min,即I/R循环2次,于心肌再灌注时同时松开夹闭的双侧髂外动脉,与心肌同时灌注至120 min。同时,在缺血末再灌注开始时,对结扎的左室支给予开通20 s-闭塞20 s,即R/I循环3次,后再灌注至120 min。

1.4 观察指标

1.4.1血流动力学监测 实验时分离左颈总动脉插管连接压力换能器与SMUP-PC1型生物信号处理系统相连,以biopac Systems AcqKnowledge软件记录血压(blood pressure,BP)和心率(heart rate,HR)等血流动力学指标。

1.4.2 心肌梗死范围测定 于再灌注末原位重新结扎左室支,从耳缘静脉注入2%Evans蓝3 ml～4 ml,2 min后剪下心脏,去除双房及右室,-20℃冰冻,沿左心室(LV)长轴横切为厚约2 mm的心肌8～9片,数码相机连续拍照,分离缺血区和非缺血区。将缺血心肌置入TTC磷酸缓冲液中染色,数码相机连续拍照,分离坏死区和非坏死区。以图像处理软件(Photoshop及image-Pro Plus图像处理系统计算各部分面积。以缺血区面积/左室面积代表缺血区范围;以坏死区面积/缺血区面积表示坏死区范围。

1.4.3 心肌酶测定 分别于结扎冠脉前及缺血末、再灌注60 min及120 min时,从右颈动脉抽血2 ml,3 500 r/min,离心10 min,分离血清,-80℃保存待测。采用生化分析仪连续监测法统一测定CPK及LDH含量,药盒购于南京建成生物工程研究所,所有试剂均为分析纯。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组血流动力学指标

从表1可看出,缺血前各组间心率(HR)和平均动脉压(MAP)均无明显差异(P＞0.05)。缺血期,各组MAP和HR亦无显著差异(P＞0.05,表1,2)。这样可以保证各组在相似的血流动力学状态下行缺血/再灌注处理,不致因血流动力学不同而影响实验结果。

Tab.1 Changes of HR in different groups(Beats/min,±s,n=6)

Tab.1 Changes of HR in different groups(Beats/min,±s,n=6)

HR:Heart rate;Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group

Group Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con 244.83±32.63 226.33±47.24 231.67±31.73 223.83±29.27 Sham 220.00±25.61 224.23±30.21 230.32±26.78 216.26±21.32 MPostC 210.00±58.99 226.67±16.33 206.67±12.11 206.67±20.66 RPostC 233.00±16.24 221.17±16.02 227.50±12.72 234.50±12.18 MPostC+RPostC 228.33±39.71 220.83±2.04 193.33±27.33 175.00±37.82

Tab.2 Changes of MAP in different groups(mmHg,±s,n=6)

Tab.2 Changes of MAP in different groups(mmHg,±s,n=6)

MAP:Mean artery pressure;Con:Controlgroup;Sham:Sham operationgroup;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group

Group Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con 77.83±10.36 68.67±4.76 77.67±14.08 78.00±12.93 Sham 80.23±12.23 78.65±5.36 82.58±6.89 90.00±9.36 MPostC 104.83±34.76 92.67±40.63 88.00±24.65 92.00±28.20 RPostC 83.17±5.15 80.17±6.67 90.33±10.80 93.17±8.03 MPostC+RPostC 100.00±7.69 73.83±11.20 91.00±7.62 90.67±2.73

2.2 心肌缺血范围和梗死范围比较

各组实验动物由结扎冠脉所造成的心肌缺血范围(AAR/LV)无统计学差异(P＞0.05)。除假手术组(Sham)外,各处理组与缺血对照组(Con)相比,坏死范围(AN/AAR)明显降低(P＜0.05)。近端后处理组(MPostC)及远端后处理组(RPostC)之间心肌AN/AAR无明显差异(P＞0.05)。但两者联合后AN/AAR值则明显降低,与MPostC组及RPostC组分别相比有显著性差异(P＜0.05,表3)。提示我们相对缺血对照组而言,除假手术组外,各组均对缺血/再灌注心肌具保护作用,而近端后处理和远端后处理的保护作用可以叠加。

2.3 各组血浆CPK及LDH含量比较

对各组血浆CPK及LDH随时间的变化趋势作图,可以看出CPK及LDH值在经过处理后1H及2H变化趋势较对照组而言明显降低(表4)。其中CPK表现尤为典型,随着再灌注时间的延长,缺血对照组CPK升高最明显,近端后处理和远端后处理组次之,两者无统计学差异,而联合处理组更次之,与心肌梗死范围相对应。

Tab.3 Ratios of AAR/LV andAN/AAR in different groups(±s,n=6)

Tab.3 Ratios of AAR/LV andAN/AAR in different groups(±s,n=6)

Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group;LV:Left ventricular;AN:Area of necrosis;AAR:Area at risk*P＜0.05 vs Con group;#P＜0.05 vs MPostC;△P＜0.05 vs RPostC

Group AAR/LV AN/AAR Con 0.3819±0.0710 0.3346±0.0805 Sham× ×MPostC 0.2396±0.0405 0.1809±0.0416*RPostC 0.3666±0.0484 0.1711±0.0774*MPostC+RPostC 0.2655±0.0595 0.0688±0.0536*#△

3 讨论

心肌缺血发生后,早期开通闭塞的冠状动脉,有效恢复缺血心肌的血液灌注,是限制和缩小梗死面积、改善预后的关键。然而再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)却严重影响了血管开通的治疗效果。I/RI是指缺血期处于可逆损伤的心肌细胞恢复血供后产生的较为严重的损伤。是一个涉及多个方面的复杂的病理生理过程。近年来,人们对减轻I/RI的方法进行了较多的研究,如有学者较多地研究了缺血预处理,并试图把它应用于临床实践中,但因临床上心肌缺血事件的不可预见性使其临床应用受到很大限制。

Tab.4 Data of CPK and LDH in different groups(U/L,±s,n=6)

Tab.4 Data of CPK and LDH in different groups(U/L,±s,n=6)

Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group;CPK:Creatine kinase;LDH:Lactate dehydrogenase*P＜0.05 vs con;#P＜0.05 vs MPostC+RPostC

Group Categorization Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con CPK 1803.83±499.42 2050.00±591.43 3832.67±894.02 6885.17±1201.82 LDH 165.10±85.17 185.15±100.18 274.15±102.06 324.42±89.01 Sham CPK 1810.33±450.53 1758.67±405.28 1880.17±561.98 1784.50±490.40 LDH 186.23±66.72 188.78±43.73 181.25±42.47 180.00±46.73 MPostC CPK 1907.67±639.90 2072.77±722.89 3249.13±756.12*# 4246.97±871.92*#LDH 63.65±28.52 96.45±33.73 135.47±40.12 249.63±144.23 RPostC CPK 1838.50±661.40 1981.83±724.67 3113.67±788.38*# 3997.33±864.77*#LDH 195.33±79.11 226.30±87.74 251.63±70.36 294.10±95.37 MPostC+RPostC CPK 1833.18±383.76 1982.28±365.48 2266.32±380.15 3122.15±655.56 LDH 79.49±35.56 111.38±50.83 143.55±38.13 221.91±87.99

而缺血后处理(ischemic postconditioning,IPO)作为一项可能行之有效的干预措施逐渐受到关注。后处理是指在冠状动脉再灌注开始即刻进行短暂、重复的开通及再闭,随后恢复冠脉血流的方法。到目前为止心肌缺血后处理心脏保护措施已经在不同动物模型及离体[2]心脏上得到证实,而且已有实验[3]证实缺血后处理产生的心脏保护作用确可达到与心肌缺血预处理相似的效果。且有学者发现,不仅心肌缺血后处理可对缺血/再灌注心肌产生保护,且体内远端主要血管的缺血后处理即远端缺血后处理也可对缺血/再灌注的心肌产生保护[4]。但心脏血管的缺血后处理以及远端器官的缺血后处理对心肌的保护作用有否差异,以及二者联合后能否叠加目前尚未见报道。

从本研究可以看出,心脏近端缺血后处理以及远端器官缺血后处理均可对缺血/再灌注心肌产生保护作用,而且两种方法同时实施,保护作用可以叠加;但两种方法之间的心肌保护作用未见明显差异。

有关近端后处理产生的机制研究较多,目前较为公认的是近端后处理产生保护作用是通过再灌注损伤补救酶通路(reperfusion injury salvage kinase,RISK)来完成其保护作用的,它可能影响线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP),一种在再灌注开始时开放能促进细胞死亡的非特异性孔的开放,进而减少心肌细胞的坏死[5]。其具体过程可以分为触发,调节及最终效应三个步骤。

触发:在后处理过程中产生或延缓清除的一些物质如腺苷和缓激肽(Bradykinin,BK)及阿片类物质等作为配体可与细胞表面相应受体结合,导致后处理过程中的级联效应,一氧化氮(NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS。需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇,包括 :O2-·、H2O2及 HO2·、·OH等)也可能参与触发。

调节:配体与细胞表面相应受体结合后激活RISK通路,结果之一就是导致磷酸化的内生性一氧化氮合酶(NOS)表达增多。这样,在NOS激活之后,环化鸟苷酸(cyclic guangylic acid,cGMP)产生,AMP依赖性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase,PKG)激活,然后 ROS产生。而 cGMP、PKG的激活,线粒体KATP的开放和ROS的产生可以被考虑为后处理的中间调解步骤,这些步骤有可能激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)。有研究证实在后处理再灌注过程中,cGMP产物增多,产生抑制MPTP开放的最终效应[6]。

最终效应:再灌注损伤的一个基础性步骤就是最终MPTP的开启。MPTP开启可以促进细胞的凋亡和坏死。而近端后处理可以明显的降低MPTP的开启,这样就能够有效的避免细胞的凋亡及坏死的发生。

同时后处理时有效减少细胞的钙超载及所造成的低 pH值环境亦是抑制MPTP开放的重要的原因[7]。

而对于远端后处理而言研究较少,有关远端缺血后适应的保护作用的确切机制目前尚不清楚。有研究[8]表明非选择性的腺苷受体阻滞剂8-SPT可以抑制肾动脉缺血后适应的保护作用。同时有研究表明[9]不同的KATP通道阻断剂消除了后处理的保护效应。以上实验证明了腺苷、K+ATP通道可能同样参与远端后适应的保护机制。但其确切机制尚需进一步研究。

这样具体到本研究而言,产生以上结果可能有如下原因:(1)近端后处理通过RISK通路起到保护作用,而远端后处理通过K+ATP通道途径起到保护作用,两者产生保护作用的途径不同,故可产生叠加效应。(2)近端后处理及远端后处理都通过RISK通路起作用,但由于近端后处理与远端后处理过程中涉及到的缺血肌肉类型不同(心肌与骨骼肌),所以产生的触发保护作用的配体物质不同,从而造成两者的保护效应的叠加。以上只是基于现有研究的推论,确切的机制尚需进一步的研究。

综上所述,心肌的缺血后处理已经成为当前的一个热门研究方向,且目前对其机制并不甚明了,本研究通过其实验结果,提示我们在临床上对于ACS的患者可以采用近端后处理(如介入治疗时球囊扩张-收缩)及远端后处理(如用止血带造成远端肢体缺血-放开)相结合的方式来进行急性冠脉介入治疗,这样对于减少患者心肌再灌注损伤,提高患者生存率及生活质量,具有十分重要的意义。

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