免疫分子佐剂ctxB在pVAX1中的初步应用

梅丽琴，曲云鹏，麻健丰，江明华

（1.温州医学院附属口腔医院 儿童口腔科，浙江 温州 325027；2.中国医科大学辽阳中心医院 口腔科，辽宁 辽阳 111000；3.温州医学院附属口腔医院 口腔修复科，浙江 温州 325027；4.温州医学院附属第二医院 检验科，浙江 温州 325027）

霍乱毒素（cholera toxin，CT）是由霍乱弧菌分泌产生，引起霍乱腹泻的主要作用物质，由A、B两个亚单位组成，A亚单位是整个毒素的活性中心；B亚单位（CTXB）没有毒性，但它含有大部分毒素抗原的决定簇，有很强的抗原性和免疫原性，可以诱导机体产生较强的免疫反应，能与大多数哺乳动物细胞膜上的神经节苷脂GMI结合，在霍乱的抗毒免疫中起重要作用[1-2]。国内外研究证实CTXB是一种较为理想的免疫分子佐剂[3]。基因防龋疫苗是近年的一个研究热点，但现有的各种核酸防龋疫苗所诱导的免疫应答效能偏低，尚不能达到实用防龋的目的[4-5]。本实验将霍乱毒素B亚单位编码基因（ctxB）克隆到真核表达载体pVAX1，构建重组质粒pVAX1-ctxB，并进一步研究其在真核细胞中的蛋白表达情况，为CTXB在防龋核酸疫苗中应用前景做基础性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒及细胞株：大肠杆菌JM109购自华美生物工程公司；CHO细胞株购自中国科学院上海细胞研究所；重组质粒p2355（含ctxB）及真核表达载体pVAX1获赠于遵义医学院刘建国教授。

1.1.2 主要试剂和仪器：限制性内切酶EcoR I和Not I、DNA分子量Marker和T4DNA连接酶均购自大连宝生物公司；lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒购自AxyPrep公司；DMEM培养基购自Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；GoldViewTM核酸染料购自赛百盛公司；Plasmid Mini Kit I购自Omega公司；引物合成由上海生工生物技术公司完成。GM1为Sigma公司产品。羊抗CTBIgG抗体和CTB标准品为List biological laboratories，Inc.产品。辣根酶标记兔抗山羊IgG抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。BSA为北京元亨圣马生物技术研究所产品。其他试剂均为国产分析纯。酶标仪为上海三科仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒p2355中ctxB插入序列的测定：对含有ctxB的重组质粒p2355进行测序，按Sanger双脱氧链终止法进行。以重组质粒p2355为DNA模板，分别以T7序列和载体近3’端序列：5’-atgatta aattaaaatttgg-3’为引物，通过一个测序反应测通。

1.2.2 引物设计合成：根据文献报道的基因序列在National Bioscience Inc研制的分子生物学软件oligo 6.0上设计合成并评价PCR引物。上游引物：5’-GCGGGTACCACCATGGATGACCGAAGCGACATCAAGC-3’；下游引物：5’-GGGAATTCTTAACTCTCAGCTGTCAAATAA TG-3’。在上游引物的5’端加入kozak启动序列和EcoR I酶切位点，在上游引物的5’端加入Not I酶切位点。

1.2.3 扩增目的基因片段ctxB：以重组质粒p2355为模板，按下列反应体系依次加样：ddH2O 36.9μL 10×Exbuffer 5μL，dNTP mixture（各2.5 mmol/L）4μL，上游引物（10 pmol/μL）1μL，下游引物（10 pmol/μL）1μL，LA Taq酶0.1μL，p2355 1μL，总体积50μL。采用的循环条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 3 m 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃贮存。取5μL PCR扩增产物上样1%琼脂糖凝胶，1×TAE，60 V×1 h检测扩增产物，于-20 ℃保存。

1.2.4 重组质粒pVAX1-ctxB的构建及酶切鉴定：PCR产物纯化按照试剂盒操作说明书进行，用EcoR I和Not I对纯化的PCR产物及少量提取的载体质粒pVAX1进行双酶切，酶切产物经凝胶电泳鉴定后回收，按照目的基因ctxB与载体pVAX1 4:1的摩尔比在T4DNA连接酶的作用下16 ℃过夜连接。取上述连接产物1μL转化感受态细胞JM109，转化后的JM109涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB抗性筛选平板上。37 ℃培养16 h后，挑取单个菌落振荡培养过夜并提取质粒，经EcoR I和Not I双酶切进行鉴定后，以可以切出目的基因条带的为阳性克隆，送至大连Takara生物技术公司测序，鉴定构建重组质粒序列。

1.2.5 脂质体介导pVAX1-ctxB瞬时转染CHO细胞：取1.0×105/mL的CHO细胞，接种至6孔培养板，每孔2 mL。24 h后，细胞汇合度达50%～80%时，进行细胞转染：①分别取96μL无血清培养基至4个1.5 mL Eppendorf管中；②取Lipofectamine 2000 4μL分别加至上面的96μL培养基中，勿碰管壁；③室温放置5 min；④加上述溶液到3个含1～2μg重组质粒及1个作为对照的含1～2μg空质粒的1.5 mL管中；轻轻混合，室温温育15～30 min；⑤沿孔周围将上述溶液加至6孔板中的4个孔中，其余2孔作为CHO空细胞对照；⑥转染细胞分别于24、48、72 h吸去培养基，冷PBS洗细胞2次。

1.2.6 GM1-ELISA法检测CHO细胞蛋白表达产物：①用10μg/mL的GM1包被96孔微孔板，每孔100 μg，4 ℃过夜。②BSA封闭移去包被液，用含5% BSA的PBS2Tween20溶液37 ℃封闭2 h。③加入CHO细胞上清液：移去封闭液，加入3种不同浓度细胞上清液稀释液（1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 μg/mL），同时设对照孔。每个浓度均设3个平行孔，每孔100μL，37 ℃作用2 h。④洗涤：移去液体，用PBS2Tween20溶液洗涤3次，每次3 min。⑤加入一抗：每孔加入1:4000稀释的羊抗CTB IgG抗体100μL，室温作用45 min。⑥洗涤：操作同④。⑦加入酶标二抗加入1:8000稀释的辣根酶标记兔抗山羊IgG抗体，每孔100μL，室温作用45 min。⑧洗涤：操作同④。⑨加入底物溶液：将底物OPD溶液加入96孔板，同时设空白对照孔。每孔100 μL，室温避光作用15 min。⑩加入终止剂测定OD值：每孔加入50μL的2 mol/L H2SO4终止反应，立即测定492 nm的OD值。

2 结果

2.1 扩增目的基因片段ctxB 以重组质粒pVAX1-ctxB为DNA模板，扩增出约390 bp的目的基因片段；经基因测序鉴定：该目的基因片段起始密码ATG到最后1个密码子，共有390 bp，与文献中报道的ctxB基因对应区域的DNA序列和氨基酸序列完全一致（见图1）。

图1 ctxB PCR产物电泳图

2.2 GM1-ELISA法检测CHO细胞蛋白表达产物 采用SPSS 13.0分析软件对GM1-ELISA实验数据进行统计学分析，经x2检验，P<0.05，证实重组质粒pVAX1-ctxB蛋白表达产物可以与特异性抗体相结合，具有CTXB免疫源性。

3 讨论

近年来CTXB作为佐剂已应用于某些细菌、病毒与寄生虫等疫苗的研制中[6]。2000年何志勇等[7]将ctxB克隆到原核表达载体，并成功诱导重组质粒在大肠杆菌中表达蛋白。选择适宜的佐剂不仅能增强机体的免疫应答，更能作用于特定免疫细胞，从而选择性地诱导形成针对特异性抗原的有效免疫应答[8-9]。有实验结果显示CTXB具有促进抗原递呈细胞的抗原递呈作用，并通过B细胞LgA型的转换使机体LgA增加，诱导Th2细胞产生细胞因子（IL-4、IL-5）等功能，并促进淋巴细胞增殖和分化，分泌Th2型细胞因子，有效地诱导局部黏膜免疫以及全身免疫，从而辅助目的基因片段增加免疫效果[10]。

本研究发现，将CTXB克隆到真核表达质粒pVAX1中，通过转染重组质粒可以在真核细胞中高效表达具有CTXB蛋白，可以用来加强防龋基因疫苗的免疫效价，为下一步构建多价防龋基因疫苗打下了基础。

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[8] Wang C,Luo J, Amer S, et al.Multivalent DNA vaccine induces protective immune responses and enhanced resistance against Cryptosporidium parvum infection[J].Vaccine, 2011,29(2):323-328.

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