Pax-8基因抑制后心肌细胞中UCP2的表达

戴晓春，黄晓燕，周希，高瞻，王本极，张艳丽，杨德业

（温州医学院附属第一医院 心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江 温州 325000）

室间隔缺损（ventricular septum defect，VSD）是常见的先天性心脏病，杨德业教授的研究组已证实Pax-8与下游基因NR4A1是和VSD生长发育相关的基因，Pax-8基因被系统敲除后，显示左心室肌和室间隔心肌细胞凋亡程度严重，同时伴有线粒体体积减少，数量增多[1-2]。大多数的研究显示，线粒体在凋亡信号转导过程中起了重要作用，特别是线粒体内膜上的解偶联蛋白 2（uncoupling protein 2，UCP2)。UCP2具有质子的转运活性，引起线粒体质子漏，使氧化磷酸化解偶联，调控线粒体合成ATP，抑制线粒体内活性氧族（ROS）[3]。ROS参与了凋亡信号转导通路的不同阶段[4]。上述研究提示UCP2是一个重要的凋亡调节基因。本实验观察Pax-8基因抑制后心肌细胞中UCP2的变化，探讨UCP2在心肌细胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：Pax-8基因敲除的纯合子小鼠（Pax-8 KO-/-）、Pax-8基因敲除的杂合子小鼠（Pax-8 KO+/-）和野生型小鼠（Pax-8 KO+/+）各10只。（Pax-8 KO+/-）小鼠由德国Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠赠。

1.1.2 细胞：H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌细胞株购自中科院上海细胞库，置于含10%胎牛血清DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO2孵箱中培养。

1.1.3 试剂：Lipofectamine 2000转染试剂盒1、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，小鼠抗大鼠Pax-8抗体、小鼠抗大鼠UCP2抗体、兔抗小鼠IgG抗体购自英国Abcam公司，小鼠抗GAPDH抗体购自上海康成生物工程有限公司，ECL化学发光显色试剂盒购自美国Cell Signal 公司，RT试剂盒购自加拿大MBI Fermentas公司，PCR试剂盒购自美国Promega公司，PMSF RIPA BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏海门碧云天试剂公司，线粒体提取试剂盒购自美国Pierce公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 PCR鉴定小鼠基因型：剪取小鼠尾尖0.5～1 cm，消化小鼠尾巴，提取DNA，进行PCR扩增反应。引物为5’-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’，5’-GC TAAGAGAA-GGTGGATGAGAG-3’，5’-GATGCTGCCAGTCTC GTAG-3’，目的基因片断长度分别为370 bp和390 bp。PCR采用20μL体系，其中含有DNA 0.8μL，10×缓冲液2μL，特异性引物各0.8μL，Taq DNA聚合酶0.15μL，dd H2O 11.45μL；反应条件：94 ℃5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，94℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，25个循环，72℃ 5 min，每组取6μL PCR产物用含Gold View的15%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统（Quantity One）摄像分析。

1.2.2 Pax-8 siRNA的表达效率：转染后48 h，Trizol试剂裂解细胞并提取细胞总RNA。Pax-8 siRNA组、NC siRNA组和空白对照组均各取3μL总RNA进行反转录反应。取各组反转录产物分别行PCR，扩增Pax-8和GAPDH片段。Pax-8上游引物为5’-CGGCAA CGCATTGTGGA-3’，下游引物为5’-GTCCTGGGCTCA GAGATTTGG-3’，产物210 bp。以GAPDH作为内参照，GAPDH上游引物为5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物为5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，产物123 bp。Pax-8反应条件：94 ℃ 5 min后，94℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。GAPDH反应条件：94 ℃ 5 min后，94 ℃ 30 s，54.6 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min每组取10μL PCR产物用于1.5%琼脂糖凝胶电泳，Quantity One凝胶成像分析系统进行半定量分析。Western blot法检测Pax-8蛋白表达水平，转染后24 h，裂解细胞提取蛋白质，BCA法测定蛋白浓度，各组上样50μg，行10% SDSPAGE电泳，转膜，7.5%脱脂牛奶封闭2.5 h。小鼠抗大鼠Pax-8抗体（1:100）4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min。室温下加入兔抗小鼠IgG抗体（1:2000）孵育1.5 h，洗膜3次。用增强化学发光法显色，X线片曝光显影。以GAPDH作为内参照标化Pax-8蛋白质表达。用Quantity One凝胶成像分析系统进行半定量分析。

1.2.3 UCP2在Pax-8抑制后心肌细胞中的表达：RTPCR法检测UCP2表达水平。提取总RNA，反转录成cDNA后，进行PCR扩增，UCP2上游引物为5’-CGACAAC CACCCAATGAAT-3’，下游引物为5’-GAGTGCCCTCAG CGAAGTC-3’，产物大小为324 bp；GAPDH上游引物为5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物为5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，产物大小为123 bp。管家基因GAPDH作为内参照标化UCP2 mRNA表达。UCP2反应条件如下：94 ℃ 5 min后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。GAPDH反应条件如下：94 ℃变性5 min后， 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，28个循环后72 ℃ 10 min，每组取6μL PCR产物用含Gold View的15%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统（Quantity One）摄像分析。Western blot法检测UCP2蛋白表达水平。取小鼠心脏组织（或心肌细胞），线粒体试剂盒提取线粒体，裂解线粒体提取线粒体的蛋白，BCA法测定蛋白浓度，各组上样100μg，进行10% SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2.5 h。小鼠抗大鼠UCP2 抗体（1:400）孵育过夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min。室温下加入兔抗小鼠IgG抗体（1:5000）孵育1.5 h，洗膜3次，10 min。用增强化学发光法显色，X线片曝光显影。以GAPDH作为内参照标化UCP2蛋白质表达，Quantity One凝胶成像分析系统进行半定量分析。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 16.0软件完成统计分析。计量资料以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，独立的两组间比较用SNK-q检验和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR鉴定小鼠基因型 雌的（Pax-8 KO+/-）和雄的（Pax-8 KO+/-）交配可获得Pax-8 KO-/-（纯合子）和Pax-8 KO+/-（杂合子），小鼠出现一条370 bp左右条带为Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO-/-），370 bp和390 bp左右条带为Pax-8基因敲除小鼠杂合子（Pax-8 KO+/-），390 bp左右条带为野生型（Pax-8 KO+/+），如图1。

图1 小鼠基因型鉴定

2.2 RT-PCR检测Pax-8 siRNA的表达效率 与NC siRNA组（mRNA为0.69±0.15，蛋白为0.75±0.10）相比，Pax-8 siRNA组Pax-8 mRNA（0.26±0.11）表达下调62.31%（P<0.05），蛋白（0.34±0.06）表达下调54.67%（P<0.05）。与空白对照组（mRNA为0.72±0.23，蛋白为0.84±0.19）比较，Pax-8siRNA组Pax-8的mRNA表达下调63.89%（P<0.05），蛋白表达下调59.52%（P<0.05）。NC siRNA组与空白对照组的Pax-8 mRNA表达差异无统计学意义，如图2。

2.3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表达上调与Pax-8基因敲除小鼠杂合子（Pax-8 KO+/-）组（mRNA为0.85±0.23，蛋白为0.86±0.14）相比，Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO-/-）组UCP2的mRNA（1.29±0.25）的表达上调34.11%（P<0.05），蛋白（1.26±0.13）的表达上调31.75%（P<0.05），与野生型（Pax-8 KO+/+）组UCP2（mRNA为0.84±0.23，蛋白为0.80±0.17）相比，实验组Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO-/-）组UCP2的mRNA表达上调34.88%（P<0.05），蛋白表达上调36.50%（P<0.05），而对照组之间，Pax-8基因敲除小鼠杂合（Pax-8 KO+/-）组和野生型（Pax-8 KO+/+）组间差异无统计学意义，如图3。

图2 Pax-8 siRNA的表达效率检测

图3 Pax-8敲除小鼠UCP2 mRNA和蛋白的表达

2.4 Pax-8 siRNA组的UCP2表达上调 与NC siRNA组的UCP2（mRNA为0.78±14，蛋白为0.77±0.19）相比，Pax-8 siRNA组UCP2（mRNA为1.07±0.08）的表达上调27.10%（P<0.05），蛋白表达（1.02±0.20）上调24.50%（P<0.05）。与空白对照组的UCP2（mRNA为0.77±0.1，蛋白为0.75±0.13）比较，Pax-8 siRNA组UCP2的mRNA表达上调28.03%（P<0.05），蛋白质上调26.47%（P<0.05）。NC siRNA组与空白对照组的UCP2 mRNA和蛋白质表达差异均无统计学意义，如图4。

图4 Pax-8基因干扰后UCP2在大鼠心肌中的表达

3 讨论

解偶联蛋白2（uncoupling protein，UCP2）属于线粒体阴离子载体家族成员，基因位于小鼠的第7条染色体、人的第11条染色体上[5]。它是一种介导线粒体质子漏的蛋白，降低线粒体在呼吸时形成的H+梯度，使氧化磷酸化解偶联，ATP合成降低，以及膜电位下降[6]。UCP2 mRNA广泛存在于骨骼肌、心肌、胎盘、肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、肺、胃、和小肠等组织及中枢神经系统内[7]，然而UCP2蛋白仅在少数组织中表达，包括胰腺、胃、脾、心、脑和肺中[8]。目前研究表明UCP2可以调节胰岛素的分泌[9]、Ca2+超载、ROS[10]的生成，以及调节ATP的合成[11]。然而，关于UCP2蛋白的生理功能仍然存在许多争论，越来越多的研究表明UCP2在不同组织中可能发挥不同的生理功能。在不同类型细胞中，UCP2过表达可能导致不同继发效应，如在成纤维细胞中，UCP2过表达对细胞的生长及存活无影响，但在HeLa细胞中UCP2过表达却能够降低线粒体跨膜电压并促进细胞死亡[12]。本实验的研究结果显示，与Pax-8基因敲除杂合子和野生型小鼠心肌细胞相比，Pax-8基因敲除纯合子小鼠心肌细胞中UCP2 mRNA和蛋白质的表达明显上调；同时，与NC siRNA组和空白对照组相比，Pax-8 siRNA组UCP2的基因和蛋白质表达明显上调，而Pax-8基因抑制后的心肌细胞凋亡明显增加[2，13]。Pax-8基因敲除的纯合子小鼠心脏研究结果显示心脏成球形，左心室壁肥厚，室间隔增厚，左心室乳头肌肥大。病理学显示左心室肌和室间隔心肌细胞凋亡程度严重， 同时伴有线粒体体积减少，数量增多。Pax-8基因敲除的纯合子小鼠在出生后即表现出心室重构[2]。左室重构时，心肌单位横截面上毛细血管密度降低，导致心肌相对供血不足，处于相对能量缺乏和低氧状态，心肌细胞ROS增多，导致线粒体溶解，甚至心肌细胞凋亡[14-15]。Maron等[16]指出，心肌肥大早期，线粒体体积代偿性增加，但是在晚期，其体积则缩小，此为肥大心肌趋于衰竭的形态特征， 心肌细胞中线粒体的机能主要和有氧代谢产生化学能有关，故其所占心肌细胞的容积与能量利用有关。我们认为可能的机制为：Pax-8基因抑制后，心室进行重构，在室间隔心室重构中，心肌细胞的肥大和纤维化增加，使单位横截面上的心肌细胞数量减少，而单位横截面上的UCP2仍然保持较高水平，说明单个心肌细胞中UCP2含量上升。心室重构导致心肌细胞产生ROS增多[17]，此时，UCP2增加虽然能拮抗ROS的增长[18]，延缓纤维化、室间隔心室重构的进程，减少细胞的凋亡，但同时使心肌细胞ATP产生的障碍加重，使细胞凋亡。

综上所述，我们推测Pax-8基因抑制后，UCP2基因的表达上调，室间隔心肌细胞凋亡程度严重。然而UCP2是一个双向因素，如果能在保证心脏能量供给充足的情况下，同时对UCP2基因进行干预，可能会减少室间隔细胞的凋亡，但是其具体机制还未明确，有待进一步研究。

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