补肾益髓方对骨质疏松症大鼠肾PKC蛋白表达的影响

孙 鑫，邓洋洋，燕 燕，王思程，尚德阳，李 楠，郑洪新

(辽宁中医药大学，沈阳 110032)

骨质疏松症(Osteoporosis OP)是以骨量减少、骨组织微细结构破坏为特征，继而导致骨脆性增加和骨折危险性增高的1种全身性骨骼疾病［1］。本病发病机制尚未阐明，其发生与诸多因素有关。

中医认为，肾主骨骨病首责于肾，“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所合也;髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足者则骨强”(清·唐宗海《中西汇通医经精义·脏腑所合》)。因此，本实验对骨质疏松症大鼠肾组织PKCα与PKCβ2蛋白表达进行研究，旨在探索骨质疏松症的发病机制以及补肾益髓中药的防治作用。

1 材料

1.1 动物

清洁级雌性4～5月龄 wistar大鼠169只，体重230g～270g，由中国医学科学院实验动物中心提供。

1.2 药物

实验药品:补肾壮骨益髓中药(牡蛎、鹿茸等)。对照药品:骨疏康颗粒剂(辽宁康辰药业有限公司)、盖天力片(东盛科技启东盖天力制药股份有限

2公司)、健脾中药补中益气汤方(辽宁中医药大学附属医院药房提供)。

1.3 试剂

兔抗 PKCα一抗(Santa Cruz)，兔抗 PKCβ2一抗(Santa Cruz)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(北京中山生物公司)，碱性磷酸酶(ALP)偶联的羊抗兔抗体(北京中山生物公司)。

2 方法

2.1 动物分组

1组:正常组;2组:假手术组;3组:模型组;4组:补肾中药低剂量组(低剂量组);5组:补肾中药高剂量组(高剂量组);6组:补中益气汤对照组(健脾组);7组:盖天力钙片对照组(盖天力组);8组:骨疏康颗粒对照组(骨疏康组)。

2.2 造模方法

手术摘除大鼠双侧卵巢的方法建立骨质疏松症模型。假手术组大鼠仅切开皮肤及皮下组织暴露双侧卵巢，但不摘除。正常组不手术。

2.3 饲养方法

正常组及假手术组大鼠正常饮水，其他各组大鼠正常饮水的同时给予相应的药物灌胃，每日1次，共3个月。大鼠等效剂量按成人每日用药量的6.3倍计算，容积为0.875ml/100g体重。

2.4 取材

实验大鼠在最后1次灌胃后，禁食24h后取材。大鼠经10%水合氯醛注射麻醉(0.3ml/100g体重)后，用碘伏消毒手术部位并采集标本。本实验保留标本包括肾(置高压灭菌 EP管内 －70℃保存)、左后肢股骨(置塑料保鲜袋内 －70℃冰箱冻存)、子宫(称取湿重)。

2.5 统计方法 统计软件SPSS11.5方差分析法，结果以均数±标准差(x珋±s)表示。

3 结果

3.1 动物模型评价

(1)骨密度 通过双能X线骨密度分析仪(附带“The Small Subject Scout Scan”软件)对大鼠离体股骨进行检测(扫描宽度15cm，长度可任意调节，扫描速度40mm/sec，分辨率为1.0×1.0 mm;结果采用单位面积内的骨矿物质含量(g/cm2)表示)，通过统计所得结果如下。与正常组比较，模型组大鼠股骨头骨密度显著降低(P＜0.01);与模型组比较，补肾中药高剂量组可显著增加骨密度(P＜0.01)，而健脾中药作用不明显，与补肾中药高剂量组差异显著(P＜0.01);(2)子宫指数:实验大鼠子宫指数统计结果显示，与正常组、假手术组相比较，模型组子宫指数明显降低(P＜0.01);(3)大鼠行为学指标:正常组大鼠皮毛光泽、活泼喜动、反应灵敏、食欲佳、无竖毛、弓背、聚堆等表现。模型组大鼠均出现弓背塌腰表现，其他表现如毛色变淡、蜷缩、聚堆、反应迟钝、喜静懒动、抗应激能力下降等症状不十分明显，补肾中药高剂量组、补肾中药低剂量组及阳性对照组的弓背塌腰表现较模型组为轻。用药各组弓背塌腰症状改善率为:低剂量组33.3%，高剂量组52.4%，健脾组15.8%，盖天力组30%，骨疏康组25%。

表1各组大鼠左后肢离体股骨骨密度比较(±s)

表1各组大鼠左后肢离体股骨骨密度比较(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.05;与正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，与模型组比较:##P＜0.01;与低剂量比较:●P＜0.05;与低剂量比较:●●P＜0.01;与高剂量比较:☆P＜0.05，与高剂量比较:☆☆P＜0.01

组 别 例数 全股骨骨密度(g/cm2)正 常 组15 0.16433±0.01466##假 手 术 组 17 0.15582±0.01138##模 型 组 21 0.14700±0.01035＊＊低 剂 量 组 21 0.15186±0.01285＊＊☆高 剂 量 组 21 0.16095±0.01593##●健 脾 组 19 0.14211±0.01127＊＊●☆☆骨 疏 康 组 20 0.14835±0.01483＊＊☆☆盖 天 力 组 20 0.15695±0.00778#

表2各组药物对肾虚骨质疏松大鼠子宫指数影响的比较(±s)

表2各组药物对肾虚骨质疏松大鼠子宫指数影响的比较(±s)

注:同表1

组别 例数 子宫指数正 常 组 15 2.0434±0.7178##假 手 术 组 17 1.8195±0.4311##模 型 组 21 0.2859±0.0469＊＊低 剂 量 组 21 0.2930±0.0501＊＊高 剂 量 组 21 0.3110±0.0694＊＊健 脾 组 19 0.2773±0.0435＊＊骨 疏 康 组 20 0.2835±0.0170＊＊盖 天 力 组 20 0.2888±0.0684＊＊

从以上结果分析，本次实验骨质疏松症大鼠模型造模成功，且以弓背塌腰症状为肾虚模型的表征信息，补肾各组优于其他各模型组。

3.2 实验大鼠肾组织 PKCα及 PKCβ2的蛋白表达情况

3.2.1 实验大鼠肾组织 PKCα蛋白表达情况

表2显示，正常组与假手术组无差异;与正常组相比较，低剂量组无差异，而其他各组均存在显著差异(P＜0.01);与模型组相比较，正常组、假手术组、低剂量组、高剂量组存在显著差异(P＜0.01)，补脾组及盖天力组有差异(P＜0.05)，骨疏康组无差异;与低剂量组相比较，正常组及假手术组无差异，模型组及其他各用组均存在显著差异(P＜0.01);与高剂量组相比，其他各组均存在显著差异(P＜0.01)(图1-1)。

3.2.2 实验大鼠肾组织 PKCβ2的蛋白表达情况 表2显示，正常组与假手术组无差异;与正常组相比较，低剂量组无差异，而其他各组均存在显著差异(P＜0.01);与模型组相比较，正常组、假手术组、低剂量组、高剂量组存在显著差异(P＜0.01)，补脾组、骨疏康组及盖天力组无差异;与低剂量组相比较，正常组及假手术组无差异，模型组及其他各用组均存在显著差异(P＜0.01);与高剂量组相比，其他各组均存在显著差异(P＜0.01)(图2-1)。

图1 蛋白表达电泳图(Western blotting法)

图2 蛋白表达电泳图(Western blotting法)

4 讨论

4.1 骨质疏松症动物模型的选择

本实验采用的骨质疏松症模型是一种比较成熟的模型，美国国立卫生研究院、世界卫生组织都推荐用此模型作为研究骨质疏松的最佳模型。大鼠分布广，繁殖快，生命周期短，便于饲养，费用较低，是目前研究骨质疏松使用最多、最成熟的造模动物。Wistar大鼠具有对传染病的抵抗力较强，自发性肿瘤发生率低等特点，十分适合用来进行与老年性疾病相关的实验。

在本实验中通过观察发现，去卵巢动物模型术后早期阶段出现了弓背塌腰的表现，是典型的肾虚症状，应用补肾中药后这些症状缓解或消失，由此我们认为此模型属肾虚，肾虚不能生髓，则髓减，使骨失所养，骨枯髓减导致“骨痿”。

4.2 骨质疏松症与肾的关系

中医认为，肾主骨，骨病首责于肾。肾虚可能是骨质疏松症发生的病机之一。“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所合也;髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内.髓足者则骨强”(清·唐宗海《中西汇通医经精义-脏腑所合》)。肾虚的机制是复杂的。本实验选取肾组织进行指标检测，一方面是探讨骨质疏松的发病机制及其治疗，另一方面可以为研究肾虚的机制提供生物学依据。

4.3 PKC与骨质疏松症的研究

蛋白激酶C(PKC)是1977年在鼠脑的胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶，由多种同工酶亚型组成，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，以其活性依赖于Ca2+而得名，参与多种生命活动，如蛋白磷酸化、信号传递、细胞增殖和分裂、跨膜离子转运、平滑肌收缩、基因表达等。［2］本实验选取PKCα与PKCβ2作为研究对象，应用补肾益髓中药对模型大鼠进行干预。

1997年崔家鹏等对肾虚骨质疏松症大鼠红细胞膜PKC的活性进行了研究。结果表明，肾虚骨质疏松症模型大鼠红细胞膜PKC的活性明显降低，经密骨灵治疗组模型大鼠与正常组接近［3］。2003年谷野等进行的体外实验表明，含密骨颗粒剂的血清可使UMR106成骨样细胞中PKC活性增强，且主要以cPKCβ为主，并能促进成骨样细胞的增殖。成骨细胞是骨代谢过程中的重要细胞，它的增殖有利于骨的形成［4］。

4.4 本实验研究结果的讨论

与正常组比较，模型组大鼠肾组织PKCα、β2蛋白表达显著降低(P＜0.01)，表明肾组织中PKC蛋白表达的变化与肾虚骨质疏松症的病理机制密切相关。肾组织中PKCα、β2蛋白表达降低，是肾虚骨质疏松症的病理机制之一，也是肾虚的病理机制之一。

补肾中药(低剂量)、补肾中药(高剂量)能够显著上调肾虚骨质疏松症模型大鼠肾组织 PKCα、PKCβ2蛋白表达(P＜0.01)，补脾中药、盖天力能够提高肾虚骨质疏松症模型大鼠肾组织PKCα蛋白表达(P＜0.05)，但对于 PKCβ2蛋白表达的升高无统计学意义，说明以上几种药物均有一定的疗效，但补肾中药效果优于其他几种对照药，说明补肾中药可以通过上调肾虚骨质疏松症模型大鼠肾组织PKCα、PKCβ2蛋白表达而起到调整肾虚骨质疏松症的作用。

在本次实验中，补肾中药的实验结果接近正常组，其它用药组与正常组存在显著差异，补肾中药防治骨质疏松的效果优于健脾中药等其他各组药物，一方面说明补肾中药的有效性，另一方面根据中医以药验证的理论说明本实验骨质疏松动物模型属肾虚证。

［1］刘忠厚.骨质疏松学［M］.北京:科学出版社，1998:142.

［2］陈敏，唐建武.PKC亚型的生物学特性与调节功能［J］.国外医学·生理病理科学与临床分册，2002，22(5):493-496.

［3］谷野，郑洪新.含密骨颗粒剂血清对 UMR106成骨样细胞增殖及 PKC活性的影响［J］.辽宁中医杂志，2003，30(7):575-577.

［4］崔家鹏，郑洪新，刘景峰，等.补肾中药对肾虚骨质疏松症大鼠红细胞膜PKC、Ca2+-Mg2+ATP酶活性影响的实验研究［J］.中国骨质疏松杂志，1997，3(3):66-69.