无比山药丸对去卵巢所致骨质疏松症大鼠胫骨骨组织形态计量学指标的影响

周晟芳，李 艳，刘梅洁，李亚楠，付小卫，潘静华，刘 红，王少君，于 峥，王 莹，宋长恒，李鸿泓，张治国，鞠大宏△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;2.浙江中医药大学，杭州 310053)

从中医角度来看，中医的“脾”和“肾”与骨质疏松症的发生密切相关，脾肾虚弱是导致该病发生的主要原因之一。无比山药丸出自《太平惠民和剂局方》，具有健脾补肾的功效，是治疗脾肾虚弱的经典方剂。基于此，本实验以卵巢切除大鼠为动物模型，采用骨组织形态计量学的方法，探讨该方对骨质疏松症的预防作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用雌性SD大鼠77只，SPF级，体重190g～220g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号 SCXK(军)2007-004)。大鼠在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室内饲养(实验动物室许可证号SYXK(京)-2010-0032)，适应性喂养10d后开始实验。

1.1.2 药物 无比山药丸方组成:山茱萸9g，泽泻 12g，熟地 12g，茯苓 9g，巴戟天 6g，牛膝 9g，赤石脂 6g，山药 15g，杜仲 9g，肉苁蓉 9g，菟丝子 12g，五味子9g。常规水煎剂，生药含量分别为1g/ml、2g/ml。盐酸雷洛昔芬片(商品名:易维特):LILLY，S.A(西班牙)生产，礼来苏州制药有限公司分包装(产品批号 A611193，分包装批号 L00835，规格:60mg/片)，使用时将其碾碎，用蒸馏水配制成浓度为0.5mg/ml的混悬液。

1.1.3 主要仪器 Reicheit-Jung2040切片机、CTR6000显微镜、Qwin V3图像分析仪系统均为德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 先将77只大鼠随机分为3组，其中空白对照组12只，假手术组12只，造模组53只。造模组大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，摘除双侧卵巢［1］，假手术组只摘取卵巢周围的少许脂肪组织。术后15d，再将造模组大鼠按体重随机分为4组，其中模型组13只，雷洛昔芬组13只，无比山药丸高剂量组14只，无比山药丸低剂量组13只。然后开始灌胃给药，无比山药丸高剂量组20g生药/kg体重，低剂量组10g生药/kg体重，给药浓度分别为2g生药/ml、1g生药/ml;雷洛昔芬组5mg/kg体重，给药浓度分别为 0.5mg/ml。给药体积均为1ml/100g体重。以上给药，1次/d，连续6d，休息1d后再连续灌服6d，如此给药3个月。空白对照组、假手术组、模型组按上法灌服等体积的纯净水。分别在大鼠处死前15d和前3d腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重，以对骨进行荧光标记。

给药结束后，将大鼠以45mg/kg体重剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将各组大鼠迅速断头处死，取右侧胫骨，用4%多聚甲醛溶液固定，制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学检测。

1.2.2 指标检测 取右侧胫骨近端1/3，去除其周围附着的软组织，采用塑料包埋法，在Reicheit-Jung2040切片机上，用钨钢刀切出纵向不脱钙骨切片;其中1张切片进行甲苯胺蓝染色，另1张切片则直接用于荧光观察。采用Qwin V3图像分析系统，按照章明放等人的方法进行骨组织形态计量［2］。

(1)骨小梁组织形态计量:骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比，是衡量骨量水平的主要标志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不规则、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判断破骨细胞(OC)的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞(OB)被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比，它可判断OB的活性;骨小梁矿化率(MAR):骨小梁表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数;(2)皮质内表面形态计量:类骨质平均宽度(OSW):皮质内表面有OB被覆的类骨质的平均宽度;骨皮质矿化率(mAR):皮质内表面双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数。

1.2.3 统计学处理方法 所得实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 无比山药丸对去卵巢大鼠胫骨TBV%的影响

表1显示，模型组及各给药组大鼠胫骨TBV%较假手术组显著降低。与模型组比较，无比山药丸高、低剂量组TBV%显著升高，无比山药丸高、低剂量组之间比较无显著性差异。阳性对照(雷洛昔芬)组的TBV%显著高于模型组。

表1 各组大鼠胫骨TBV%的变化

2.2 无比山药丸对去卵巢大鼠胫骨TRS%的影响

表2显示，模型组、无比山药丸高、低剂量组和雷洛昔芬组与假手术组比较，骨吸收参数TRS%显著升高;而与模型组比较，无比山药丸高、低剂量组和雷洛昔芬组的TRS%皆显著降低。

表2 各组大鼠胫骨TRS%的变化

2.3 无比山药丸对去卵巢大鼠胫骨TFS%和MAR的影响

表3显示，与假手术组比较，模型组、无比山药丸高、低剂量组和雷洛昔芬组大鼠胫骨TFS%和MAR明显升高，而无比山药丸高、低剂量组和雷洛昔芬组的TFS%和MAR均低于模型组。

表3 各组大鼠胫骨TFS%的变化

2.4 无比山药丸对去卵巢大鼠胫骨mAR和OSW的影响

与假手术组比较，模型组大鼠胫骨的 mAR和OSW均明显增高。无比山药丸高剂量组mAR与模型组相比明显降低，OSW无显著性差异;无比山药丸低剂量组mAR和OSW与模型组相比皆无显著性差异。雷洛昔芬组的 mAR和OSW与模型组比较显著降低，与假手术组相比无显著差异。

表4 各组大鼠胫骨mAR和OSW的变化

假手术组的上述指标与空白对照组相比，均无显著性差异，从而排除了手术因素对实验结果的影响。

3 讨论

本实验采用骨组织形态计量学方法对各组大鼠胫骨不脱钙骨切片进行了形态计量。结果显示，摘除大鼠卵巢3个月后，作为衡量骨量多少的重要指标TBV%显著降低，而衡量骨吸收的指标TRS%以及衡量骨形成的指标TFS%、MAR、mAR和OSW皆显著增高，说明摘除卵巢所建立的骨质疏松症模型属于高转换型，即摘除卵巢可使骨吸收与骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，从而导致骨质疏松症的发生，这与人类绝经后骨质疏松症的发生相一致。给大鼠灌服无比山药丸后，除高剂量的OSW以及低剂量的mAR、OSW外，均可使上述指标发生一定程度的逆转。这一结果表明，无比山药丸对去卵巢所致的骨质疏松症有一定的预防作用。无比山药丸之所以能产生这样的作用，从中医学角度来看，主要是由于其具有健脾补肾的功效。如《太平惠民和剂局方》中载其“治丈夫诸虚百损，五劳七伤……或冷痹骨疼，腰髋不随，饮食虽多，不生肌肉……此药能补经脉……厚肠胃，强筋练骨。”

中医理论认为，肾藏精主骨生髓，肾精充实，则骨骼坚固有力，正如《医经精义》所云:“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之合也。髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”若肾精亏虚，骨髓化生乏源，骨失其养，则骨脆易折，也就会导致骨质疏松症的发生。肾为先天之本，脾为后天之本，肾精的充实有赖于脾运化的水谷精微来滋养和补充;若脾失运化，水谷精微等营养物质不能正常生成和输布，则肾精乏源而致肾精亏虚，进而导致骨质疏松症的发生。由上观之，中医的“脾”、“肾”在维持骨代谢方面发挥着重要作用，脾肾虚弱是导致骨质疏松症发生的主要原因之一。本研究从实验角度为这一认识提供了进一步的科学依据。

［1］鞠大宏，张春英，王安民，等.温补肾阳方对去卵巢所致骨质疏松症大鼠 IL-1和 IL-6活性的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，张乃鑫，谭郁彬.运动对雌性大鼠去势后骨质疏松症的作用［J］.中华骨科杂志，1994，14(6):365-369.