玉米SSR引物和甘蔗EST－SSR引物在芒属中的通用性研究

卢玉飞，蒋建雄，易自力

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙410128）

芒属（Miscanthus）（禾本科Poaceae）是一类C4高大禾草。因其具有适宜作为新一代非粮食能源植物开发利用的潜力而备受关注［1－4］。按 Chen和 Renvoize［5］的分类体系，中国的芒属植物包含芒（Miscanthus sinensis）、五节芒（M.floridulus）、荻（M.sacchariflorus）、南荻（M.lutarioriparius）、尼泊尔芒（M.nepalensis）、双药芒（M.nudipes）和红山茅（M.paniculatus）等7个种。尽管我国的芒属植物资源丰富，但对其遗传多样性的了解并不多。

微卫星，或言之简单序列重复（simple sequence repeats，SSRs）以一种由短的碱基基序构成的长阵列形式广泛分布于真核生物基因组内，长1～6bp（base pairs，bp）［6，7］。根据开发SSR标记所依据的序列的不同性质，SSR标记可分为基因组SSR（genomic SSR，gSSR）和表达序列标签SSR（expressed sequence tags SSR，ESTSSR）［8］。EST是通过对cDNA文库中随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA的5′或3′端序列，长度一般为150～500bp［8］。EST－SSR是指EST序列中包含的SSR，因来源于编码DNA而与基因表达有关［9］。作为功能基因的一部分，EST－SSR的侧翼区往往受到功能性约束而使得其歧化速率慢，所以该侧翼区序列在物种间很保守。已有研究表明，这2种SSR标记在物种及其近缘种间，甚至在该物种与某些远缘种之间都具有比较高的通用性［7，10－12］。

由于通过文库筛选来开发SSR引物的成本高昂，并且因为通过公共数据库搜索来获得适用序列来开发芒属SSR引物的机会也小，因此根据SSR侧翼区序列保守性的特点，从现有近缘种的SSR引物中筛选获取可用于芒属植物扩增的SSR引物是一个现实选择［10］。Hernández等［10］考察了76对玉米（Zea mays）SSR引物在2份芒属杂交种中的扩增情况，并接着使用了11份材料开展多样性研究，结果表明玉米的微卫星引物在芒属中的通用性很高。钟智林等［13］比较了30对玉米SSR引物在15份芒属材料中的扩增情况，结果表明玉米SSR引物适用于芒属植物遗传多样性分析。Hung等［14］的研究则表明来自芒的9个微卫星位点在五节芒中能实现种间扩增。马洪峥等［15］利用尼泊尔芒和双药芒的6份材料，筛选得到14对能产生稳定扩增的SSR引物，并进而评价认为所获得的这14个SSR位点在双药芒组遗传学研究中的适用性强。Zhou等［16］从芒中开发了14个SSR位点，其中12个在五节芒、荻、南荻中能实现种间扩增。Ho等［17］的研究则表明源自M.sinensis fo.glaber的转录区的12个多态性微卫星位点能在芒的所有变种及五节芒中实现类群间扩增。

本研究以我国芒属植物的全部7个种为材料，对382对玉米SSR引物和100对甘蔗（Saccharum officinarum）EST－SSR引物的通用性进行研究，寻找适用于芒属相关遗传学研究的SSR引物，并在此基础上初步探讨中国芒属种质资源的遗传多样性，为开展相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

实验材料采自湖南农业大学芒属种质资源圃。80份芒属材料以及作为外类群的4份甘蔗属（Saccharum）材料的详细信息见表1。类群名称按Chen和Renvoize［5］的分类体系。

1.2 引物

382对玉米SSR引物为Sigma－Aldrich公司产品（St.Louis，MO USA）；100对甘蔗EST－SSR引物序列由美国Illinois大学Erik Sacks博士提供，由北京奥科生物技术有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA提取 每份材料从一个单株里选取生长状况良好的新鲜健康嫩叶，总DNA提取方法参照CTAB法［18］并稍加改良。所有DNA母液于－70℃保存。

1.3.2 引物筛选 引物筛选分2个环节进行：前期筛选以获得初步认为有效的引物、应用初步有效的引物对上述84份材料进行扩增。在前期引物筛选（即初筛）环节，每次扩增电泳同时检测若干对引物，从芒属的每个类群及每个外类群中各抽取1～3份材料来使用。扩增反应体系为15μL，含2μL（约50ng）模板DNA、0.02 mmol／L 引物、2.5mmol／L Mg2＋、0.2mmol／L dNTPs、0.5UTaq DNA polymerase（广州东盛生物技术有限公司）、1.5μL 10×PCR buffer。扩增反应在PCR仪 （Biometra，Germany）上完成。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，56～60℃退火30s，72℃延伸1min，循环数35；72℃保持7min。根据扩增结果和已有经验，完全无带或仅有细带或弱带的引物都舍弃，认为该引物无效。其中，2008年11－12月完成玉米SSR引物的前期筛选，这当中使用的部分供试材料不在上述84份材料之列，筛选时使用的退火温度通常为58℃，少量引物使用60℃；甘蔗EST－SSR引物的前期筛选是于2010年1－2月使用上述84份材料中的部分材料来完成的，筛选时所有引物使用的退火温度均为56℃。用于每次扩增的材料都同时包含了中国芒属植物的至少大部分种类。

然后，进一步应用初步认为有效的引物对上述84份材料进行扩增。扩增反应体系和程序同前期筛选所应用的，但已根据初筛的扩增情况来适当调整了退火温度。扩增产物通过12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，AgNO3染色检测。选择扩增条带清晰且有多态性的引物来使用，舍弃扩增效果不佳或条带过于复杂而无法准确判读的引物。每一对确定有效的引物在优化好退火温度后，都将保持相同条件再重复一遍扩增和电泳以检验扩增条带的稳定性。根据在同一电泳迁移位置上稳定、清晰的扩增条带的有／无，记为1／0矩阵。为确保读带的误差尽可能小，带型过于复杂而无法准确判读的扩增条带都舍弃不读。

1.3.3 数据处理 计算不同引物的多态性条带百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）。采用 NTSYSpc－2.10e［19］软件计算遗传相似度（genetic similarity，GS），并按非加权类平均法（unweighted pair group method with arithmetic averaging，UPGMA）进行聚类。

表1 84份供试材料Table 1 84accessions of plant materials

续表1 Continued

2 结果与分析

2.1 引物筛选

从382对玉米SSR引物和100对甘蔗EST－SSR引物中，初步筛选获得在供试类群中至少都能产生较清晰主带的引物分别有92对（24.08%）和29对（29.00%），初步认为这些引物是有效引物。利用这些引物对上述84份材料统一进行PCR扩增，条带较清晰且有多态性的分别为54对（14.14%）、19对（19.00%）。其中一些引物因扩增条带不清晰或者因为其中某些条带过于复杂以致无法在所有供试材料中准确判读等因素而被放弃使用，剩余39对（10.21%）玉米SSR引物和13对（13.00%）甘蔗EST－SSR引物，条带清晰稳定且能准确无误判读，而用于进一步的遗传分析。

用筛选获得的这52对引物对上述84份材料进行PCR扩增，结果共得到250条带，平均每对引物获得4.81条，每对引物扩增条带数为2～9条。部分引物的扩增图谱如图1和图2所示。其中在芒属中总共得到220条带，绝大多数条带大小在100～200bp，平均每对引物获得4.23条；这当中多态性条带206条（93.64%），平均每对引物3.96条。其中，在玉米SSR引物和甘蔗EST－SSR引物中各有1对引物，即分别为p－umc1170和BQ537250a，它们在芒属材料中表现为单态性。

图1 玉米SSR引物p－mmc0132的扩增图谱Fig.1 Amplification products from the locus of p－mmc0132from maize SSR

图2 甘蔗EST－SSR引物BQ478949a的扩增图谱Fig.2 Amplification products from the locus of BQ478949afrom sugarcane EST－SSR

2.2 特异性条带

这52对引物在对上述80份芒属供试材料进行PCR扩增时，扩增条带中出现了一些可能比较有利用价值的特异性条带（表2）。在中国芒属植物中，它们仅为某一或某些类群所拥有，这些类群在本研究中称为专属类群。

2.3 玉米SSR引物与甘蔗EST－SSR引物扩增效果对比

这2种引物的扩增效率非常相近，但甘蔗EST－SSR引物的多态性稍强于玉米SSR引物的（表3）。倘若在数据分析中去掉在内类群材料芒属中扩增结果无多态性的p－umc1170和BQ537250a这2对引物，甘蔗ESTSSR引物的扩增效率和多态性均略优于玉米SSR引物的。

2.4 聚类分析

采用NTSYSpc－2.10e软件计算得到的遗传相似系数（GS）为0.588～0.988。聚类结果（图3）表明，在GS＝0.68水平上，中国芒属植物分为两大类群：第一类由尼泊尔芒、双药芒、红山茅构成，第二类由芒、五节芒同荻、南荻组成；在GS＝0.82上，第二类又分成了由芒与五节芒构成的一支和由荻与南荻构成的另一支；在GS＝0.88上，芒与五节芒分开，各自成为一个分支。这些分支以及由荻和南荻构成的分支又各自形成了很多次级分支。

表2 39对玉米SSR引物和13对甘蔗EST－SSR引物在芒属中的扩增效果Table 2 Amplification effects of 39maize SSR primer pairs and 13sugarcane EST－SSR primer pairs in Miscanthus

续表2 Continued

表3 玉米SSR引物与甘蔗EST－SSR引物在芒属中的扩增效果对比Table 3 Comparison on amplification effects between maize SSR primer pairs and sugarcane EST－SSR primer pairs in Miscanthus

图3 80份芒属材料的UPGMA聚类图Fig.3 UPGMA clustering figure for the 80accessions in Miscanthus

3 讨论

3.1 SSR标记的通用性

Hernández等［10］的研究表明，76对玉米的SSR引物里有57对（75%）引物在芒属DNA中实现可重复扩增。使用其中的17对引物扩增芒属的11份材料，遗传相似度为0.35～0.92，结果表明玉米的微卫星引物对芒属的通用性很高。马洪峥等［15］的研究则表明，核心芒属的SSR位点在双药芒组中的同源扩增比率为52.17%。

本研究中，这382对玉米SSR引物以及100对甘蔗EST－SSR引物往往都能产生扩增条带，但一些引物因扩增条带很细弱或者在全部84份供试材料中只产生一条带而被剔除。而且为了确保条带统计时的准确性，条带过于复杂而无法准确判读的那些引物也被舍弃。经过这2次筛选，最后可用的引物不多，这导致了本研究中这2种引物的通用性较低。已有研究表明EST－SSR引物较普通SSR引物的通用性效果更佳［20］。而从本研究结果来看，总体上甘蔗EST－SSR引物较玉米SSR引物的通用性稍好一点，对揭示中国芒属种质资源的遗传多样性更为有效。这反映了基于源自转录区的EST开发而来的EST－SSR标记比传统SSR标记更保守，通用性更强。

3.2 特异性条带与芒属资源评价

当前中国芒属植物中的4个主要类群：芒、五节芒、荻和南荻是最为引人关注的，因为它们生物量大、分布广，应用潜力大，尤其是南荻植株高大且冬季枯黄，极具应用潜力。本研究揭示的这些特异性条带将有可能为中国芒属种质资源的评价、分子辅助育种提供可靠依据。比如，本研究表明在上述80份芒属的供试材料中，引物pmmc0132扩增条带中的170bp这条带是仅荻与南荻共有的条带，引物p－umc1542扩增条带中的130bp这条带是仅芒与五节芒共有的条带，引物p－bnlg125扩增条带中的280bp、引物p－umc2036扩增条带中的150bp、引物CA069343b扩增条带中的370bp等这些条带是仅芒、五节芒、荻和南荻共有的条带。这些条带将为这些类群的杂交种鉴定及种质资源评价提供帮助。而对于那些中国芒属植物7个种类都共有的带，可以利用它们来帮助鉴定一些疑似材料是否属于芒属。

3.3 芒属种质资源的遗传多样性

芒属种质资源及其遗传多样性是芒属能源作物遗传改良和新品种育种的基础。对中国芒属植物遗传多样性的评价有利于了解其遗传背景、促进有利基因发掘、鉴定最优亲本组合。本研究结果初步表明中国芒属植物种质资源蕴含比较丰富的遗传多样性。同时表明，芒、五节芒、荻和南荻的相似性较高，相似度为0.780～0.988，说明它们之间的遗传距离较近，遗传基础可能相对较为狭窄。而尼泊尔芒、双药芒、红山茅同这4个大家平常都比较容易关注到的种类的遗传距离却较远。它们主要分布于西南高山地区，具有一定程度的耐寒和抗旱特性。建议在选育适宜作为能源作物开发利用的芒属新品种时，亲本选配可以适当考虑这三者，以拓宽遗传基础，发掘有利基因，促进中国芒属植物的遗传改良和新品种培育。

致谢：感谢美国Illinois大学的Erik博士提供了甘蔗EST－SSR引物序列。

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