中国人非小细胞肺癌B-RAF基因（V600E）突变的研究

翟笃明，王松林，贾淞淋，郭成业

（1.长春市中心医院 胸心外科，吉林 长春 130051；2.长春市医学高等专科学校，吉林 长春 130031）

中国人非小细胞肺癌B-RAF基因（V600E）突变的研究

翟笃明1，王松林2，贾淞淋1，郭成业1

（1.长春市中心医院 胸心外科，吉林 长春 130051；2.长春市医学高等专科学校，吉林 长春 130031）

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因编码的蛋白为 M a PK通路中的丝氨酸苏氮酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至EKI／2，从而参与调控多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。BRAF在多种肿瘤存在突变，其中以结直肠癌突变率最高，突变率约为15%左右，在恶性黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌，肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的突变［1，2］。BRAF基因的突变位点主要位于基因的第15外显子，其中约92%位于第1799位核苷酸上（T突变为A），导致其编码的谷氨酸被解氨酸取代（V600E）［3］。

在非小细胞肺癌进行针对表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase Inhibitors，TKIs）进行的小分子靶向药物（易瑞沙，特罗凯）治疗的过程中发现：在K-RAS没有突变的患者中也产生了针对靶向药物的抗性，研究发现部分与B-RAF基因（V600E）突变有关［4］，因此在进行肺癌靶向治疗前进行B-RAF基因突变的检测对于判别治疗药物的敏感性有一定的指导意义。当前对于B-RAF基因（V600E）在我国非小细胞肺癌组织突变的情况还未见研究报道，因此本研究针对160例非小细胞肺癌组织进行突变检测，并分析突变与临床联系，有助于筛选出适合非小细胞肺癌靶向治疗的人群。

1 材料与方法

1.1 标本资料

收集160例非小细胞肺癌患者手术后的石蜡标本。在160例患者中，女性50例（31.25%），男性110例（68.75%）；年龄35岁－88岁，中位年龄为60岁；吸烟患者100例（62.50%），不吸烟患者60例（37.50%）；病理类型：腺癌81例（50.63%），鳞癌64例（40.00%），腺鳞癌15例（9.47%）；Ⅰ期33例（20.63%），Ⅱ 期 32 例 （20.00%），Ⅲ 期 82 例（51.25%），Ⅳ期13例（8.12%）；肿瘤分化程度：低分化77例（48.13%），中、高分化83例（51.87%），所有病理学类型及TNM分期均按照WHO标准。

1.2 B-RAF基因（V600E）突变测序分析

应用石蜡切片DNA提取试剂盒（FFPE gDNA miniPREP KIT，BIOMIGA）进行肿瘤组织DNA提取。以提取的DNA为模板进行B-RAF基因第15显子扩增。扩增引物为：上游引物：CCTCATCCTAACACATTCAAGCC， 下 游 引 物：CTTTCTAGTAACTCAGCAGCCATCTC，PCR产物长度为426bp。PCR反应体系为20μl，包括：3.0μl DNA（0.2μg），1μl primer（10μmol），10μl 2×HotStart Taq PCR MasterMIX（北京天根公司），6μl DEPC-treated water。PCR 产 物 应 用ABI3130型遗传学分析仪测序，测序引物为PCR扩增上游引物。

1.3 统计学分析

应用Fisher’s检验分析了K-RAS基因突变与性别、组织学类型和吸烟状态、分化程度及分期之间的关系，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 B-RAF基因（V600E）的突变检测情况

通过PCR扩增反应，所用检测对象均可以扩增出B-RAF基因的第15外显子基因片段，其片段大小在426bp（结果见图1A）。以PCR产物为模板，应用ABI3130测序仪进行基因测序，测序结果通过分析发现在检测的样本内检测到B-RAF基因的野生型（GTG，V）以及突变型（GAG，E）分布，突变型均为杂合性突变（结果见图1B，1C），在160例患者中，8例患者存在突变，占5%。

2.2 B-RAF基因突变同患者临床特点之间的关系

在8例发生B-RAF基因突变的患者中，6例为腺癌（6／81；7.14%），2例为鳞癌（2／84；3.12%）；7例为女性（7／50；14%），1例为男性（1／110；0.9%）；4例为吸烟者（4／100；4%），3例为非吸烟者（3／60；5%）。B-RAF基因突变同性别有关，女性患者突变率明显高于男性。B-RAF基因突变与肿瘤细胞的分化有关，低分化肿瘤该基因的突变率明显高于中高分化的肿瘤组织。该基因的突变与病理类型、吸烟情况以及分期均无相关性。结果见表1。

图1 B-RAF基因（V600E）的突变检测结果

表1 BRAF基因突变与临床特点关系

3 讨论

B-RAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤因肉瘤中发现并克隆确认的。B-RAF基因位于7q34，编码783个氨基酸的蛋白，在绝大多数组织和细胞类型中，B-RAF是MEK／ERK最为关键的激活因子。B-RAF蛋白的主要功能为有丝蛋白激酶（MAPK）通路中的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，激活多种因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-RAF基因突变主要有两种类型：（1）11%的突变位于外显子11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等点突变；（2）89%的突变发生于外显子15上的激活区，其中约92%位于第1 799位核苷酸上（T突变为A），导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代（V600E）。激酶激活后活性比野生型B-RAF提高500倍。突变后的B-RAF持续性激活 MAPK通路，使前有丝分裂原有效分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化［5］。

国外的研究学者发现在非小细胞肺癌的患者肿瘤组织内存在部分的B-RAF基因突变。其突变率大约在3%左右［6］。B-RAF突变与非小细胞肺癌患者的生存率有一定的关系，具有B-RAF基因突变的患者预后较差［7］。在本研究检测的非小细胞肺癌患者的B-RAF突变发现，B-RAF的突变与性别有关，女性突变的比例明显高于男性，而我国学者在进行大规模人群EGFR测序以及靶向分子药物治疗相关性中得到的研究结论是在非小细胞肺癌的患者中性别为女性、不吸烟以及病例类型为腺癌的患者其EGFR突变率较高，更适合应用靶向药物治疗［8，9］。而本研究中发现的女性的B-RAF突变率较高，突变率在病理类型以及是否吸烟没有差异。同时以往的研究表明B-RAF突变可与EGFR基因的突变同时存在，而B-RAF突变的患者将不会从EGFR靶向治疗药物中获益。因此在进行针对EGFR进行靶向分子治疗过程中，应事先进行B-RAF突变的检测。

当前针对B-RAF（V600E）突变的肿瘤靶向药物已经进入Ⅰ期临床研究，显示良好的临床效果以及 较 低 的 毒 副 作 用［10，11］。 因 此 针 对 B-RAF（V600E）突变的肿瘤患者在不能应用针对EGFR靶向分子治疗的同时，也可以应用针对B-RAF（V600E）突变的靶向药物。通过针对 B-RAF（V600E）突变的检测不仅进一步丰富了非小细胞肺癌的分子分型研究，同时也为其治疗提供新的治疗靶点与策略。

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1007－4287（2012）02－0304－03

2010－12－20）