活动性结核病患者全血干扰素诱导蛋白10测定及免疫状态的研究

王 莹，吴雪琼，于 庭

（1.吉林大学第二医院，吉林 长春 130041；2.解放军第309医院 全军结核病研究所，北京 100091）

活动性结核病患者全血干扰素诱导蛋白10测定及免疫状态的研究

王 莹1，2，吴雪琼2＊，于 庭1＊

（1.吉林大学第二医院，吉林 长春 130041；2.解放军第309医院 全军结核病研究所，北京 100091）

目的 研究全血干扰素诱导蛋白10（interferon-inducible protein 10，IP-10）对活动性结核病的辅助诊断价值及活动性结核病患者免疫状态。方法分别应用植物血凝素、纯化的结核分枝杆菌CFP10／ESAT6融合蛋白刺激人全血产生IP-10，用化学发光免疫分析法检测105例活动性结核病患者、52例非结核肺部疾病患者、29例健康对照者全血中IP-10水平；绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）确定其诊断活动性结核病的临界值，并评价其诊断效能。结果活动性结核病组非特异性IP-10水平（868±513pg／ml）高于健康对照组（549±365pg／ml，P＜0.05）与非结核呼吸疾病组（738±459pg／ml，但P＞0.05）。活动性结核病患者组结核特异的IP-10的水平为（287.16±236.49pg／ml），显著高于非结核呼吸疾病组（56.35±20.54pg／ml，P＜0.001）和健康对照组（52.20±28.28pg／ml，P＜0.001）。活动性肺结核组全血中结核特异的IP-10水平（317±258pg／ml）显著高于活动性肺外结核组（232±167pg／ml，P＜0.05）；活动性结核涂片抗酸杆菌染色阳性组结核特异的IP-10水平（302±283pg／ml）高于活动性结核涂片阴性组（285±218pg／ml，但P＞0.05）；活动性结核PPD皮试阳性组结核特异的IP-10水平（338±222pg／ml）显著高于活动性结核PPD阴性组（241±105pg／ml，P＜0.05）。结核特异的IP-10诊断结核病的临界值为89pg／ml，其灵敏度和特异性分别为85.7%和88.9%。结论活动性结核病患者免疫反应增强，全血结核特异的IP-10检测可能成为活动性结核病辅助诊断指标之一。

结核；γ-干扰素诱导蛋白10；免疫；诊断

（ChinJLabDiagn，2012，16：0240）

结核病是机体被结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的呼吸道传染病。统计表明2008年全世界新增结核感染者890万－990万［1］，近年来肺结核发病人数及死亡人数已居传染病之首，早期诊断结核病对控制结核疫情至关重要。诊断结核病的金标准是检出病原体，但是此种方法灵敏度低。因此，需要一种快速、准确的实验室诊断方法。ESAT6和CFP10是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离出的两种特异性分泌蛋白，有较强的免疫原性，它们主要存在于结核分枝杆菌复合群中，卡介苗及大多数其它分枝杆菌中则缺乏该蛋白［2］，因此可以用于鉴别结核菌感染者和卡介苗接种者。γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRA）是一种定量检测全血在结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6和CFP10多肽刺激下释放γ-干扰素（IFN-γ）水平的方法。目前已有被美国FDA批准应用该原理的Quanti FERON-TB试剂盒，用于结核菌潜伏感染者的检测［3］，但IGRA在免疫低下的患者中检测的灵敏度较低［4］。近年来有文献报道IP-10在活动性肺结核患者体内的高水平表达［5］，Ruhwald M 等［6］研究表明活动性肺结核患者血浆中IP-10水平显著高于IFN-γ，其检测的灵敏度较高。因此，本研究应用植物血凝素（PHA）、纯化的结核分枝杆菌重组CFP10／ESAT6融合蛋白体外刺激全血后，检测活动性结核病组与非结核呼吸疾病组及健康对照组中IP-10水平，研究其对活动性结核病的辅助诊断价值及活动性结核病患者的免疫状态。

1 对象和方法

1.1 对象

1.1.1 试剂与仪器 CFP10／ESAT6融合蛋白由解放军第309医院全军结核病研究所克隆、表达、纯化，置－80℃保存备用。植物血凝素（PHA）系SIGMA公司产品。细胞培养液为RPMI-1640培养基（Solarbio公司产品）添加10%小牛血清（杭州四季青公司产品）。γ-干扰素诱导蛋白10试剂盒（包括IP-10捕获抗体、IP-10检测抗体和链亲合素-辣根过氧化酶）为美国BD公司产品。化学发光检测仪为北京科美东雅发展有限公司产品。

1.1.2 对象 （1）105例活动性结核病患者抗凝标本来源于解放军第309医院结核科2010年10月至2011年5月期间，根据我国1992年修订的《结核病的诊断标准和分类》确诊为活动性结核病的住院患者，其中肺结核患者73例，肺外结核患者32例（包括结核性胸膜炎患者15例、结核性脑膜炎9例、颈部淋巴结核患者4例、肾结核1例、乳腺结核1例、结核性腹膜炎1例和盆腔结核1例）。其中男性62例，女性43例，年龄14～83岁，平均40±19岁。

（2）52例非结核肺部疾病患者抗凝标本来源于解放军第309医院呼吸科同期入院的肺炎和肺气肿等其他肺部疾病住院患者。其中男性27例，女性25例，年龄1－82岁，平均61±20岁。

（3）29例健康人抗凝标本同期选择来自解放军第309医院2011年硕士研究生志愿者。其中男性19例，女性10例，年龄25－31岁，平均27±2岁。

1.2 实验方法

1.2.1 抗酸杆菌涂片 用接种环挑取标本（包括痰标本、胸腔积液标本、脑脊液标本）0.05－0.1ml，在玻璃片右侧三分之二处均匀涂沫成2cm卵圆形膜。抗酸染色，光学显微镜镜检（目镜10X，油镜100X）。抗酸杆菌呈红色，找到抗酸杆菌3－9条／100视野以上为抗酸杆菌阳性。

1.2.2 PPD皮肤试验 吸取卡介苗 PPD 0.1ml（5IU），采用曼图氏法注射于前臂掌侧皮内。于注射后72h由解放军309医院结核科医务人员检查注射部位反应。若硬结横径及纵径的平均数≥5 mm为阳性。

1.2.3 全血特异性抗原刺激培养 采集肝素钠或枸橼酸钠抗凝血2－4ml，在4h内进行检测。每份标本设置3孔，加入24孔培养板中，分别为阴性对照不加任何刺激物，阳性对照加植物血凝素（PHA）至终浓度20μg／ml，检测孔加结核特异的CFP10／ESAT6融合蛋白至终浓度20μg／ml，置37℃、5%CO2培养箱22－24h。

1.2.4 IP-10检测 用包被液1∶250稀释单克隆抗体，4℃包被过夜。次日用洗涤液PBST（含0.05%Tween20的PBS，pH7.0）洗涤3次，3min／次，加入10%小牛血清37℃封闭1h，洗涤3次，3min／次，用洗涤液稀释抗原（1∶10稀释培养上清和IP-10标准品），每孔100μl，37℃孵育2h，洗涤5次，3 min／次。用洗涤液稀释IP-10检测抗体及链亲合素－辣根过氧化酶，37℃孵育1h后，洗涤7次，3 min／次。加入底物，室温避光反应5分钟。应用化学发光检测仪读取结果，根据IP-10标准曲线计算IP-10含量（pg／ml）。阴性孔系未刺激时IP-10的基础水平；阳性孔系PHA非特异性刺激后的IP-10水平；受试者全血中结核特异的IP-10水平系检测孔IP-10含量减去阴性孔IP-10含量。

2 结果

2.1 健康对照组、非结核呼吸疾病组、活动性结核病组全血中IP-10水平186例受试者全血加入结核特异性蛋白刺激后，通过化学发光酶免疫分析法检测健康对照组、非结核呼吸疾病组、活动性结核病组全血培养上清中IP-10结果见图1、表1。活动性结核病组外周血淋巴细胞数略高于非结核呼吸疾病组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。三组未刺激孔的IP-10水平差异也无统计学意义（P＞0.05）。活动性结核病组非特异性IP-10水平高于健康对照组（P＜0.05）与非结核呼吸疾病组（P＞0.05），非结核呼吸疾病组高于健康对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。活动性结核病组结核特异的IP-10水平显著高于非结核呼吸疾病组和健康对照组（P＜0.001），而健康对照组与非结核呼吸疾病组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 受试者全血培养结核特异的IP-10值分布

2.2 活动性结核病分组中全血IP-10水平结果见表2，活动性肺结核组全血中结核特异的IP-10水平显著高于活动性肺外结核组（P＜0.05）；活动性结核病分组中涂片抗酸杆菌染色阳性组结核特异的IP-10水平与涂片阴性组差异无统计学意义（P＞0.05）；活动性结核病分组中PPD皮试阳性组结核特异的IP-10水平显著高于PPD阴性组（P＜0.05）。

2.3 ROC曲线分析及各组IP-10结果判定

以敏感性为纵坐标、1－特异性为横坐标绘制结核特异的IP-10的ROC曲线（图3）。应用软件SPSS17.0计算IP-10的曲线下面积是0.906，标准误是0.022，95%置信区间（0.863－0.949）。根据ROC曲线得出的IP-10的诊断临界值（89pg／ml）判定结果，105例活动性结核病组中90例阳性，灵敏度为85.7%；29例健康对照组中2例（6.9%）阳性，52例非结核呼吸疾病组中7例（13.5%）阳性，总的特异性为88.9%。

表2 不同结核病组全血培养上清中IP-10水平

图3 结核特异的IP-10ROC曲线

3 讨论

目前应用IGRA检测结核感染者已取得较高的灵敏度及特异性，但对机体内的结核杆菌感染是否处于活动性的诊断仍有待解决。IP-10是由IFN-γ所诱导产生的一种趋化因子，它主要由活化的单核巨噬细胞、各种淋巴细胞等产生，并具有强大的招募T淋巴细胞、单核巨噬细胞的作用。IP-10不仅在体外可以诱导外周血单个核细胞（PBMC）表达IFN-γ，同时在体内也可以募集Th1型细胞分泌IFN-γ，刺激炎症组织局部产生IP-10，从而使IP-10的分泌不断增强。虽然IFN-γ和IP-10差异的免疫学机制尚未完全阐明，但目前的研究表明IFN-γ可能是由特异性抗原呈递细胞（APC）与特异性T细胞相互作用产生的；而IP-10是由许多细胞因子 （IL-1、IL-2、IFN-γ、IFN-a、TNF-a）的信号和受体介导的相邻 T细胞的信号联合诱导APC产生的。由于IP-10并不完全依赖于IFN-γ的表达，也可由不产生IFN-γ的T细胞亚群诱导产生，因此，IP-10可能成为比IFN-γ更敏感的检测 T 细胞识别 的工具［7，8］。Frahm M［9］等和Goletti D［10］等研究结果均表明应用结核特异蛋白刺激全血后，以Quanti FERON-TB商品试剂盒作为对照，发现IP-10在鉴别结核感染者和非结核感染的健康人时，比IFN-γ具有更高的敏感性。但关于活动性结核病与非活动性结核呼吸疾病患者IP-10的比较研究国内外尚未见报道。

人体初次感染MTB后，机体特异性T细胞被激活并释放少量的细胞因子。当受试者全血受到结核特异性的蛋白刺激后，曾被MTB激活的记忆T细胞就会对这些特异性抗原产生反应，发生增殖分化并释放出大量IP-10。因此，本文的研究结果显示活动性结核病组结核特异的IP-10水平显著高于非结核呼吸疾病组和健康对照组，而健康对照组与非结核呼吸疾病组差异无统计学意义。IP-10是由单核巨噬细胞及各种淋巴细胞分泌，全血中淋巴细胞数可能影响其产生水平，本研究结果表明，活动性结核病组外周血淋巴细胞数尽管略高于非结核呼吸疾病组，但无统计学意义，说明IP-10只是由机体内结核特异的、活化的T淋巴细胞分泌表达，而静止的T淋巴细胞低表达或不表达。活动性肺结核组结核特异性IP-10水平显著高于活动性肺外结核组，可能是肺外局部的MTB进入血循环量较少，外周血中特异性T淋巴细胞受MTB特异性抗原刺激较少所致。活动性结核病分组中涂片阳性组结核特异的IP-10水平与涂片阴性组差异无统计学意义，表明结核特异性IP-10水平可能与体内的结核菌含量无关。活动性结核病分组中PPD皮试阳性组结核特异的IP-10水平显著高于PPD阴性组，可能与机体的免疫状态有关，他们均是已确诊的活动性结核病患者，而PPD呈阴性反应可能因为机体细胞免疫功能低下、重度结核或无反应结核，导致结核特异的IP-10分泌减少。由于本文PPD阴性组例数较少（8例），我们将进一步研究两者之间的关系。本研究通过ROC曲线确定IP-10临界值为89pg／ml，它辅助诊断活动性结核病具有较高的灵敏度和特异性（分别为83.2%、88.9%），与Frahm M［9］等研究结果一致，其应用IP-10诊断结核感染的灵敏度和特异性分别为84.1%、96.2%。由此可见，IP-10可能成为结核病辅助诊断和鉴别诊断的有用工具。

Ruhward M 等［4］应 用 ESAT-6、CFP-10 和TB7.7蛋白刺激全血后，以Quanti FERON-TB商品试剂盒为对照，发现IP-10检测结核感染者和非结核感染者的灵敏度和特异性高于IFN-γ，并且对于免疫功能低下或缺陷的人群检测结核特异性IP-10的水平比IFN-γ更有意义。Ruhward M 等［11］认为应用IP-10代替IFN-γ或者与IFN-γ联合检测可能对于结核感染的检测、结核病辅助诊断和鉴别诊断更具有临床价值。

本研究活动性结核病组、非结核呼吸疾病组和健康对照组中患者平均年龄差异较大（P＜0.05），可能患者年龄影响全血中IP-10水平。但每份标本均用PHA作为阳性对照孔，它是一种非特异性抗原，可非特异性地激活机体T淋巴细胞分泌细胞因子，已广泛用于判断机体的基础免疫力。本研究活动性结核组非特异性IP-10水平显著高于健康对照组，略高于非结核呼吸疾病组但无统计学差异；而非结核呼吸疾病组也略高于健康对照组却无统计学意义，说明患者年龄对全血中IP-10释放水平并无影响，且患者患病后机体细胞免疫均有所增强，尤其是活动性结核病患者更显著，这可能与患者体内MTB特异性抗原持续刺激，使特异性T淋巴细胞处于过度免疫反应状态有关。

Azzurri A等［12］的研究发现活动性结核病组无抗原刺激的全血的IP-10水平显著高于结核潜伏感染组，认为IP-10可用于活动性结核病和结核潜伏感染的鉴别诊断，但Alessandri AL等［13］的研究结果却显示这两组间并无显著差异。由于本研究并未在健康对照组和非结核呼吸疾病组中检测结核潜伏感染者，三组未刺激孔的IP-10水平差异无统计学意义（P＞0.05），因此，无法判断无抗原刺激的全血中IP-10的水平是否可用于活动性结核和结核潜伏感染的鉴别诊断。

通过对本研究结果分析表明，活动性结核病患者免疫反应增强，结核特异的IP-10水平显著高于非结核呼吸疾病患者和健康人，全血IP-10检测可能成为结核病辅助诊断指标之一。今后我们将扩大样本进一步研究全血IP-10和全血IFN-γ对活动性结核病的辅助诊断价值。

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［6］Ruhwald M，Bodmer T，Maier C，et al.Evaluating the potential of IP-10and MCP-2as biomarkers for the diagnosis of tuberculosis［J］.Eur Respir，2008，32（6）：1607.

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［11］Ruhwald M，Dominguez J，Latorre I，et al.A multicentre evaluation of the accuracy and performance of IP-10for the diagnosis of infection with M.tuberculosis［J］.Tuberculosis，2011，91（3）：260.

［12］Azzurri A，Sow OY，Amedei A，et al.IFN-gamma inducible protein 10and pentraxin 3plasma levels are tools for monitoring inflammation and disease activity in Mycobacterium tuberculosis infection［J］.Microbes Infect，2005，7（1）：1.

［13］Alessandri AL，Souza AL，Oliveira SC，et al.Concentrations of CXCL8，CXCL9and sTNFR1in plasma of patients with pulmonary tuberculosis undergoing treatment［J］.Inflamm Res，2006，55（12）：525.

The analysis of IP-10in human blood and the active tuberculosis patients＇immune states

WANGYing1，2，WUXueqiong2，YUTing1.（1.TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China；2.TuberculosisResearch Laboratory，The309thHospitalofPLA，Beijing100091，China）

ObjectiveTo exploit the value of interferon-inducible protein 10 （IP-10）in active tuberculosis＇s auxiliary diagnosis and immune status of the active tuberculosis patients.MethodsThere were 186human whole blood samples，105samples of active tuberculosis patients，52samples of non-tuberculous pulmonary disease patients and 29healthy controls，stimulated by PHA and purified fusion protein CFP10／ESAT6of mycobacterium tuberculosis respectively to produce IP-10.The level of IP-10was evaluated by chemiluminescence enzyme immunoassay.Then the receiver operating characteristic curve was drawn to determine the threshold of IP-10for diagnosis of active tuberculosis and to evaluate its diagnostic performance.ResultsThe non-specific IP-10levels of the active tuberculosis group（868±513pg／ml）was higher than that of the healthy control group（549±365pg／ml，P＜0.05）and that of the non-tuberculous pul-monary disease group（738±459pg／ml，butP＞0.05）.The specific IP-10level of active tuberculosis group（287.16±236.49pg／ml）was significantly higher than that of non-tuberculous pulmonary disease group（56.35±20.54pg／ml，P＜0.001）and that of the healthy control group（52.20±28.28pg／ml，P＜0.001）.The specific IP-10level of active tuberculosis group（317±258pg／ml）was significantly higher than that of the extra-pulmonary tuberculosis group（232±167pg／ml，P＜0.05）.The tuberculosis-specific IP-10level of the active tuberculosis acid-fast bacilli smear-positive group（302±283pg／ml）was higher than that of the active tuberculosis smear-negative group（285±218pg／ml，butP＞0.05）.The specific IP-10level of PPD the active tuberculosis tuberculosis skin test positive group（338±222pg／ml）was significantly higher than that of the active tuberculosis PPD-negative group （241±105pg／ml，P＜0.05）.The threshold of IP-10for diagnosis of tuberculosis was 89pg／ml and its sensitivity and specificity were 85.7%and 88.9%respectively.ConclusionThe immune response strengthens in tuberculosis patient and the whole blood tuberculosis special IP-10examination may become one of the active tuberculosis auxiliary diagnostic targets.

tuberculosis；interferon-inducible protein 10；diagnosis；immunity

R521

A

1007－4287（2012）02－0240－05

国家重大传染病防治科技重大专项基金资助（2008ZX10003-001）；吉林省科技厅课题（ 200505115；201115079）

＊通讯作者

2011－04－13）