临床分离肺炎克雷伯菌中整合酶基因的检测分析

杨 朵，王占伟，郭 宇，张 正＊

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院 临床检验中心，北京 100038；2.北京大学人民医院 检验科，北京 100044）

临床分离肺炎克雷伯菌中整合酶基因的检测分析

杨 朵1，王占伟2，郭 宇2，张 正2＊

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院 临床检验中心，北京 100038；2.北京大学人民医院 检验科，北京 100044）

＊通讯作者

近年来肺炎克雷伯菌已成为医院感染的重要病原菌，同时院内分离的肺炎克雷伯菌往往有较高的产超广谱β－内酰胺酶（ESBL）率并呈现多重耐药性［1，2］。在肠杆菌科细菌耐药机制中，整合子起着非常重要的作用［3］，通过位点特异性基因重组机制使细菌耐药基因盒（gene cassette）整合在一起，形成多种耐药基因的组合和排列，导致不同耐药基因的水平传播。因此，研究整合子的流行状况对于了解一个地区耐药基因的传播状况具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌株

2006年1月－2006年12月北京大学人民医院临床标本分离的150株肺炎克雷伯细菌。标准菌株包括：大肠杆菌 ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853，肺炎克雷伯菌ATCC13883，肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定与药敏试验 全部菌株经VITEK 2初步鉴定并做药敏。是否产ESBL经双纸片确证法证实，不能经双纸片法确证的菌株经表型法进行证实［4］［用亚胺培南（IPM 10μg）、头孢吡肟（FEP 30μg）、头孢他啶／克拉维酸（CD02 30μg／10μg）、头孢噻肟／克拉维酸（CD03 30μg／10μg）、头孢噻肟（CTX 30μg）5种纸片进行筛选。判断标准：IPM表现为敏感，而FEP、CTX、CD02、CD03均耐药，提示待测菌株产ESBL的同时也产生其他β－内酰胺酶，如产AmpC酶］。

1.2.2 肺炎克雷伯菌质粒DNA的提取 采用北京赛百盛公司质粒快速提取试剂盒（碱裂解法）进行提取。

1.2.3 整合酶基因的测定 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合酶简并 引 物［5］如 下：5’-TGCGGGTYAARGATBTKGAT-3’，5’-CARCACATGCGTRTARAT-3’。简并引物（混合碱基）代码：Y＝C／T，R＝A／G，B＝G／T／C，K＝G／T。退火温度41℃，延伸时间50秒，无菌pH8.0的TE溶液为阴性对照，产物大小：491bp。符合片段大小的PCR产物由北京奥克生物技术有限公司经胶回收纯化后应用PRISMTM377DNA测序仪进行DNA测序。

1.2.4 整合酶PCR产物的酶切反应［5］取 PCR反应产物2μl（约0.2μg）进行 HinfⅠ酶切。37℃作用2h。简并引物PCR产物（491bp）经HinfⅠ酶切后，Ⅰ类整合酶仍为491bp，Ⅱ类整合酶为300 bp＋191bp，Ⅲ类整合酶为372bp＋119bp。

1.2.5 酶切产物检测 产物在2%琼脂糖凝胶（含0.5μg／ml EB）上于1×TAE中120v电压电泳60分钟，凝胶成像系统显像观察。

1.2.6 统计学分析 显著性差异采用卡方检验，P＜0.05判断为有显著性差异。药物敏感率、产ESBL率采用WHONET 5.3软件统计。

2 结果

2.1 ESBL阳性率及药敏结果

在150株肺炎克雷伯菌中，共有68株产ESBL，ESBL阳性率为45.3%，见表1。

表1 150株肺炎克雷伯菌对9种药物的敏感率（%）

2.2 整合酶基因检测结果

ESBL阳性菌中整合酶携带率为66.2%（45／68），其中Ⅰ类44株，Ⅱ类1株。ESBL阴性菌中整合酶携带率为47.6%（39／82），其中Ⅰ类37，Ⅱ类1株，Ⅲ类1株。

2.3 统计学结果

ESBL阳性菌与阴性菌间整合酶携带率有统计学差异，χ2＝5.23，P＜0.05。

图1 部分整合酶PCR产物的酶切产物检测

图2 部分整合酶PCR产物的酶切产物检测

3 讨论

整合子被认为是耐药基因水平传播的重要因子，其独特结构可捕获外源性基因，并使之转变为功能性基因的表达单位，是一种通过转座子或接合性质粒将多种耐药性在细菌中水平传播的耐药基因［6］，故其在细菌的耐药传播中起到重要作用。整合酶基因为整合子的遗传标记。本研究显示，临床分离的肺炎克雷伯菌中产ESBL与不产ESBL菌对药物的敏感性有较大差异，ESBL阳性菌不但对头孢类，对氨基糖苷类（庆大霉素），喹诺酮类（环丙沙星），磺胺类（甲氧苄啶／磺胺甲硝唑）敏感性均较ESBL阴性菌低。同时ESBL阳性菌与阴性菌间整合酶携带率有统计学差异。携带有整合酶的菌株更易获得多个耐药基因，而ESBL阳性菌整合酶携带率较高，这可能是其对多种抗菌药物敏感性均较低的原因之一。

根据整合酶基因的同源性将整合子分为4型。本研究发现肺炎克雷伯菌中存在Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型整合子。Ⅰ型整合子在革兰阴性细菌中分布最广、检出最多，不同菌属的检出率随菌株分离的地方、时间、对象等不同而有变化，主要携带编码对β－内酰胺类，氨基糖苷类，甲氧嘧啶，氯霉素和链霉素等抗生素耐药性的基因［7，8］。本实验结果显示肺炎克雷伯菌中Ⅰ型整合子的总体携带率为56%（84／150）。同时检测到一株可疑Ⅲ型整合子。国外研究资料显示，肠杆菌科细菌中Ⅲ型整合子检出较少，其可携带耐广谱β－内酰胺类抗生素耐药基因和氨基糖苷类耐药基因。在没有抗生素压力的环境中整合子的携带率仅为3.6%［9］，但在医院高强度抗生素选择下，整合子的总体携带率达到了56%。在此情况下，只有加强抗生素的合理使用及医院感染管理，减少细菌捕获耐药基因的可能，才能降低多重耐药的发生与传播。

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［3］戴晓莉，苏兆亮，陈建国，等.临床分离的革兰阴性菌3类整合酶基因的筛查与Ⅰ类整合子结构分析［J］.中国感染与化疗杂志，2009，9（1）：152.

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［9］Jonesm E，Peter E，Weersink AM et al.Wide spread occurrence of integrons causing multiple risistance in bacteria［J］.Lancet，1997，349（11）：1742.

1007－4287（2012）01－0144－02

杨朵（1970－），女，副主任技师，博士学位，从事临床微生物检验。

2010－10－12）