洁净室微生物监测培养基的选择

柴海毅

（上海诺狄生物科技有限公司，上海 201612）

GB/T 16293-2010医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法和GB/T 16294-2010医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法中微生物监测的培养基采用的是大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏琼脂培养基（SDA），而《中国药典》2010年版微生物限度检测选用的培养基分别是营养琼脂（NA）和玫瑰红钠琼脂（RBA）。作为微生物限度检测的环境微生物监测，如何来确定环境微生物监测的培养基呢？

洁净室微生物监测方案的确定，实质上就是培养基的选择和培养条件的确定。用于环境微生物监测的培养基首先必须具备的就是要有良好的广谱性，即对目标微生物的选择性很低，可以满足大多数需氧微生物的生长。大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏琼脂培养基（SDA）作为微生物培养全能型培养基的杰出典范，早就已经成为USP/EP中微生物限度检验的细菌、真菌（包括：霉菌、酵母菌）的首选，也成为制药洁净环境微生物监测中浮游菌或沉降菌监测培养基的不二选择。

微生物限度检验培养基的确定国外药典（包括：USP，EP和JP）是依据微生物自身营养条件确定的，而中国药典则是按照微生物的类别确定的。这就形成了目前中国药典与国外药典在微生物限度检验方面培养基的不同。随着中国药典微生物检测中培养基标准的进一步提高和国产培养基行业的逐步规范，中国药典定会收载大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏琼脂培养基（SDA）作为微生物限度检测培养基的主要种类，本文就以大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏琼脂培养基（SDA）为主要培养基来设计洁净环境监测方案。

任何一个环境监测方案都必须包括对空气、表面和人员的监测。下面就针对以上三个监测对象的环境监测方案中培养基和培养条件的确定分别讨论。

1 空气监测

浮游菌或沉降菌作为空气微生物监测的主要方法，理想的培养基应该是大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏琼脂培养基（SDA）。

1.1 需氧微生物总数（TAMC）

培养后在TSA培养基上发现有真菌生长，应当按需氧菌来计数。培养条件的确定：如果选是要计数需氧微生物总数，培养条件可以采用分别在20℃～25℃，30℃～35℃各培养3天，先高温后低温。如果是仅计数细菌总数，培养条件可以采用30℃～35℃培养5天[1]。

1.2 真菌总数（TYMC）

如果某产品本身对真菌（包括霉菌和酵母菌）有严格要求，或环境中真菌的生物负荷比较大，这时的环境微生物的监测方案中就不能仅有TSA培养基一种了，还必须使用沙氏琼脂培养基（SDA）来监测真菌。培养条件可以是20℃～25℃培养5天。同样，如果培养后，在SDA培养基上发现有细菌生长，应当按真菌来计数。在这里应该注意一点的是，如果因为细菌的生长，会使总真菌数或酵母菌总数超过了规定的限度，则应该在沙氏琼脂培养基（SDA）中加入少量的抗生素抑制细菌的生长，通常是在配制沙氏琼脂培养基（SDA）时加入1%的氯霉素。

2 表面监测

表面作为洁净室的主要污染源之一，也是环境监测的主要内容。医药工业洁净室内不可避免会留有消毒剂的残留，抗生素生产车间的抗生素残留以及部分有抑菌作用药物API的残留，都会造成洁净室表面微生物监测结果的“假阴性”。GMP2010就明确指出如果被监测环境中使用过消毒剂或有抗生素，则要向表面监测用培养基中加一些添加剂[2]。如何有效的防止这种“假阴性”结果的出现，唯一有效的办法就是在用于表面监测的培养基中加入一些添加剂。在A级、B级这些洁净等级较高的洁净区浮游菌，沉降菌的取样，还应特别关注培养基平皿的无菌性。非最终灭菌的取样平皿，会带来监测结果的“假阳性”。特别值得注意的是，为尽力避免监测“假阳性”结果，国内制药企业多采用实验室配制平皿100%预培养后再取样的步骤，预培养后的平皿如果没有经过促生产试验（Growth Promotion Test），又会产生另一种的“假阴性”的结果。

表面微生物监测主要的取样方法有接触平皿法、擦拭法和表面冲洗法。三种方法各有优劣，分别适用于不同的表面取样，测试数据都能够用来评估洁净环境表面微生物的污染水平。

接触取样平皿（Replicate Organism Detection and Counting）作为快速取样测试，而且可以定量监测的表面微生物的方法，越来越被广泛采用[3]。

表面微生物监测培养基的选择，洁净环境中消毒剂残留对微生物的影响是设计表面监测方法不得不直面的问题。国外越来越多的制药公司在表面微生物培养时，选择的培养基是大豆酪蛋白+吐温80+卵磷脂琼脂培养基（即TSAWLP），吐温80+卵磷脂中和剂可以降解掉表面可能残留的季铵盐类消毒剂（新洁尔灭等），因而添加有吐温80+卵磷脂的TSA培养基可以方便地应用在使用了季铵盐类消毒剂的表面。采用大豆酪蛋白+吐温80+卵磷脂琼脂培养基的培养条件可以等同采用需氧微生物总数的培养条件。

3 人员监测

人是洁净环境中的最大污染源，生产操作人员卫生的控制和监测直接影响着洁净室的环境等级。强调生产操作人员对洁净环境的影响，首先是要严格规范洁净区，尤其在A级，B级区操作人员的各种行为，因为洁净区操作人员的行为是维持洁净区平衡不可或缺的。

操作人员卫生检查基本与表面微生物监测类似，培养基的选择上可以忽略消毒剂等得影响，不必选用添加有中和剂的培养基，可以直接使用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏琼脂培养基（SDA），但不可忽略抗菌素和API的影响。除此之外，完全可以等同采用空气监测的培养条件。

[1] European pharmacopoeia,7.0, Microbiological examination of nonsterile products: microbical ecumeration tests, 2010, 2-12.

[2] 国家食品药品监督管理局药品认证管理中心. 药品GMP指南（无菌药品分册）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2011，353.

[3] 国家食品药品监督管理局药品认证管理中心. 药品GMP指南（无菌药品分册）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2011,358.