汉防己甲素抑制人工晶状体前膜形成的实验研究

陈学国，田学敏，邹 倩，曹小勇，张百珂

(解放军第153中心医院眼科 河南 郑州 450042)

人工晶状体前膜是白内障摘除及后房型人工晶状体植入术后一种严重的早期并发症。目前治疗的主要药物是皮质类固醇。但它的副作用限制了其临床应用。本研究观察汉防己甲素对人工晶状体前膜形成的影响。

1 材料和方法

1.1 一般资料 选择日本大耳白兔36只，年龄4～6月;体重(2.76±0.43)kg。5号针头自角膜缘穿刺进入前房，划破晶状体前囊约5 mm长，做成双眼外伤性白内障模型。外伤性白内障3 d后，剪开结膜，角膜缘后做巩膜板层切口，刺入前房，分离虹膜后粘连，截囊，水解晶状体核，扩大切开，取出晶状体核，抽净皮质。植入后房型人工晶状体于囊袋内或睫状沟内。

1.2 实验动物分组及处理 随机分为3组，每组12只。汉防己甲素组、地塞米松组和空白对照组分别结膜下注射汉防己甲素注射液5 mg(0.5 ml)、地塞米松注射液2 mg(0.5 ml)和生理盐水注射液 0.5 ml，每日1 次，共7 d。

1.3 实验指标测定 术后第3、5、7天裂隙灯显微镜下房水闪光分级［1］。术后第 3、7、14、28 天，裂隙灯显微镜下检查人工晶状体前膜的形成情况并分级［2］。术后第1、3、7、14 天抽取0.2 ml房水。将所得房水注入血细胞计数板的计数池中1滴，计数房水细胞总数。余离心后吸取沉淀物制成厚膜涂片，行瑞氏姬姆萨联合染色，镜检，计数并分类［3］。离心后上清液稀释2倍约0.3 ml，其中 0.2 ml稀释上清液加入丙二醛(MDA)测定试剂中，95℃水浴40 min，然后以4 000 r/min离心10 min，上清液用721型分光光度仪在532 nm处比色，得吸光值。通过样品含量=(测定管吸光度－测定空白管吸收光度)/(标准吸光度－标准空白管吸光度)×2×10 nmol/ml，得出房水中MDA含量。其余稀释上清液再稀释10倍后取0.1 ml加入考马斯亮兰G250染色液中，混匀后在室温中放置15 min，用721型分光光度仪在595 nm处比色测定吸光度，从标准曲线中查出相应的蛋白质含量。

1.4 人工晶状体病理检查 术后第7、28天，处死实验兔，切取角膜并摘出人工晶状体。角膜迅速用0.25%台盼兰染液和0.2%茜素红染液联合染色共3～4 min，用生理盐水冲洗掉染料，镜检，计数内皮细胞密度。第7、28天每组各取出2枚人工晶状体，立即放入2.5%中性戊二醛固定溶液中固定8 h，磷酸缓冲液漂洗，乙醇梯度脱水，CO2临界点干燥，装台，样品处理仪上溅射金膜及导电处理，上扫描电镜观察。

取出的其余人工晶状体立即固定于Bouin液中，行HE染色，观察人工晶状体表现细胞及前膜形成情况。人工晶状体表现分成4个象限，每个象限随机计数两个高倍视野，计数细胞总数并分类［4］。

1.5 统计学分析 采用SPSS13.0软件包，前房水浑浊程度及人工晶状体前膜形成程度用成组设计多样本秩和检验和两两比较的秩和检验;房水细胞数、人工晶状体表面细胞总数、角膜内皮细胞数、蛋白质和丙二醛含量用均数±标准差(±s)表示，选用方差分析和多样本均数两两比较q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 房水闪光分级 术后第3天汉防己甲素组与地塞米松组之间比较差别无统计学意义(P＞0.05)。术后第5、7天汉防己甲素组与对照组之间比较差别有统计学意义(P＜0.01);地塞米松组与对照组之间比较差别有统计学意义(P＜0.05);而汉防己甲素组与地塞米松组之间比较差别无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 人工晶状体前膜 人工晶状体前膜术后第1天不明显，第3天开始出现至28天显著。第3、7、14、28天汉防己甲素组、地塞米松组与对照组之间比较差别有统计学意义(P＜0.01)。汉防己甲素组人工晶状体前膜轻于地塞米松组，但两两比较结果显示两组间比较无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 房水细胞计数及分类 汉防己甲素组、地塞米松组房水细胞总数明显低于对照组(P＜0.01);汉防己甲素组与地塞米松组相似(P＞0.05)。第1天以中性粒细胞为主，第3天后变为以巨噬细胞为主。

2.4 房水蛋白质含量和房水丙二醛含量 汉防己甲素组与地塞米松组房水蛋白质含量明显低于对照组(P＜0.01);汉防己甲素组与地塞米松组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。汉防己甲素组、地塞米松组房水丙二醛含量明显低于对照组(P＜0.01);汉防己甲素组与地塞米松组相比无统计学意义(P＞0.05)。

2.5 人工晶状体表面细胞、角膜内皮细胞密度分析结果及人工晶状体表面光镜及电镜检查结果 人工晶状体表面主要由巨噬细胞和成纤维细胞组成。汉防己甲素组、地塞米松组人工晶状体表面巨噬细胞、成纤维细胞、异物巨细胞明显低于对照组(P＜0.01);汉防己甲素组与地塞米松组相比无统计学意义(P＞0.05)。汉防己甲素组、地塞米松组与对照组角膜内皮细胞密度基本一致，比较差别无统计学意义(P＞0.05)。对照组人工晶状体表面可见大量且较厚的纤维蛋白膜。膜中间掺杂有大量的细胞成分，以巨噬细胞为主。巨噬细胞胞呈高活化状态。汉防己甲素组人工晶状体表面纤维蛋白膜较少且菲薄，细胞成分小，以巨噬细胞为主，呈非活化状态。地塞米松组同汉防己甲素组相似。

3 讨论

3.1 汉防己甲素的抗炎、抗氧化作用 汉防己甲素是由防己科植物防己中提取的双苄基异喹啉类生物碱。含有多个烷氧基。对炎症的多个环节有抑制作用［5］。本研究发现，术后房水中有大量的白细胞聚集。第1天以中性粒细胞为主，术后第1～14天随时间推移白细胞数逐渐减少，而单核巨噬细胞数逐断增多。汉防已甲素组和地塞米松组术后细胞总数、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞计数明显低于对照组(P＜0.05)，汉防已甲素组与地塞米松组相比差别无统计学意义(P＞0.05)，提示汉防已甲素能够广泛抑制术后房水中各种类型的白细胞聚集，无明显特异性，且与地塞米松作用相似。汉防已甲素组的蛋白质含量明显减少，与对照组相比差别有统计学意义(P ＜0.01)，提示汉防已甲素能够减轻血－房水屏障的紊乱和降低炎症反应的程度。本研究发现，术后各组房水中丙二醛的含量随着损伤的修复而逐渐减少。汉防己甲组丙二醛的含量明显少于对照组(P＜0.01)。表明汉防已甲素明显抑制术后前房中脂质过氧化反应，减轻眼局部组织损伤，因而对术后眼组织产生保护作用。

3.2 汉防已甲素抑制人工晶状体表面细胞反应的作用 白内障摘除人工晶状体植入术后，人工晶状体表面出现一系列细胞反应。汉防己甲素具有免疫抑制作用，主要对迟发型过敏反应好发生和慢性肉芽肿性炎形成中起关键作用的巨噬细胞和细胞因子起作用。能明显降低白介素-1和α－转化因子的mRNA的表达水平，阻滞其合成。并且抑制单核细胞的增生和白介素-2、白介素-4和γ-干扰素的产生，抑制巨噬细胞的活化，降低其氧耗量，抑制其呼吸爆发的过程［6］。本实验人工晶状体植入术后，其表面发生巨噬细胞、成纤维细胞、异物巨细胞、超大巨细胞和淋巴细胞参与的细胞反应，以巨噬细胞为主，早期尚有中性粒细胞参与。吞噬细胞胞质内吞噬较多的颗粒，表面突起多，微绒毛丰富，可谓高活化状态。超大巨细胞、异物巨细胞表面均有大量巨噬细胞粘附，并有融合趋势。局部应用汉防已甲素后人工晶状体表面巨噬细胞、异物巨细胞、成纤维细胞数均明显少于对照组，巨噬细胞呈非活化状态，异物巨细胞、超大巨细胞表面突起少，提示局部应用汉防已甲素可显著减轻人工晶状体表面细胞反应，抑制细胞的活性，并且抑制巨噬细胞、成纤维细胞、异物巨细胞、超大巨细胞的转化，阻断其演变过程，从而达到抑制人工晶状体表面细胞反应的目的。

3.3 汉防已甲素对人工晶状体前膜的抑制作用 人工晶状体前膜的形成是多因素参与或介导的结果。与术后炎症反应、免疫反应和细胞增生等多种因素有关。本研究结果显示，人工晶状体植入术后，均发生不同程度的炎症反应，主要以细胞聚集和蛋白质渗入为主，3 d就形成Ⅱ级人工晶状体前膜的实验兔，其术后炎症反应时间长，人工晶状体表面可见大量细胞沉积 ，且细胞成高活化状态。局部应用汉防已甲素后，炎症明显减轻，人工晶状体表面增生减弱，细胞呈非活化状态，人工晶状体前膜与空白对照组比较差别有统计学意义(P ＜0.01)。现代研究发现，汉防己甲素既是一种Ca2+通道阻滞剂，又是钙调蛋白拮抗剂。推测汉防己甲素抑制人工晶状体抑制人工晶状体前膜的机制为:①抑制了术后眼内炎症反应。②抑制了术后眼内免疫反应。③抑制了成纤维细胞的增生［7］。值得提出的是，汉防已甲素抑制人工晶状体前膜的程度与地塞米松作用相似(P＞0.05)，但由于汉防已甲素无明显毒副作用，可长期使用［8，9］，因而可认为汉防已甲素可能成为一种很有前途的抑制人工晶状体前膜的药物。

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