IVF-ET周期中1PN及0PN胚胎的非整倍体研究进展

韦 多，张翠莲，宋小兵，谢娟珂，刘 琦，呼 琳，殷宝莉

(河南省人民医院生殖医学中心 河南郑州 450003)

在人类体外授精-胚胎移植(in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET)技术中，国内外许多学者在授精18～20 h内通过光学显微镜对胚胎原核数目进行观察及评分［1］，以观察到明确的2PN(pronucleus)及2PB(polar body)作为正常受精的判断标准［2］，从中选择优质的胚胎进行移植。1PN、0PN通常被视为异常受精胚胎［3］，与多原核及发育停滞的2PN胚胎一同作为废弃胚胎被销毁，目前此方法被广大中心所采用。但是出现这种现象的原因一部分是由于错过了最佳的观察时机，从而可能造成胚胎资源的浪费。从提高IVF-ET成功率，降低治疗周期取消率，减少染色体病患儿出生的角度出发，如果要将这部分胚胎加以利用，研究其染色体非整倍体性，对判断其移植价值有着重要意义。

1 对1PN及0PN胚胎利用的必要性

染色体非整倍体改变在人类IVF-ET周期中十分常见，它可导致自发流产、死产以及早期胚胎丢失等，进而造成妊娠失败。21号染色体三倍体引起的Down综合症患者发育迟缓、智力低下，13号染色体三倍体患者智力严重缺陷且伴有兔唇。染色体疾病在人群中的爆发率相当高，在新生儿中，发病率高达7.3‰，18号染色体三倍体所引发的Edward综合症在人群中的爆发率也高达1/2 000。研究表明，13、18、21、X和 Y染色体异常所引起的疾病占新生儿染色体疾病的85%～90%。染色体非整倍体改变是导致胚胎移植后受孕率低、胚胎着床率低且流产率高的重要原因之一［4］。异常受精胚胎因染色体非整倍体发生率较高而常被废弃，不用于移植［5］。在IVF-ET治疗过程中，约4%的患者因受精异常等原因而没有正常受精胚胎移植，导致治疗周期取消，这给患者精神上带来很大的痛苦和压力，同时也造成了财力及人力的大量浪费。

细胞遗传学研究［1］显示大部分3PN胚胎为三倍体或单倍体和二倍体的嵌合体，尽管有10%左右的3PN胚胎显示为二倍体，但异常的纺锤体结构和数目可能导致异常的细胞分裂，从而产生高比例的复杂嵌合体胚胎，因此，3PN胚胎是不适于移植的。Manor等［6］研究发现0PN胚胎中57%(13/23)为二倍体胚胎，另外有学者通过细胞遗传学方法发现，发生分裂的1PN胚胎中80%为二倍体，12%为单倍体，7%为三倍体［7］。0PN及1PN胚胎中的二倍体胚胎均占有较大比率。

在体外受精-胚胎移植技术中，1PN和0PN胚胎的发生率分别约为3% ～6%［8］和30% ～40%，这是一个不小的比例。多数学者认为，异常受精胚胎常存在染色体非整倍体异常，不具有移植价值［6，9］，多数中心也选择授精第2天观察受精原核为2PN的胚胎移植。但是，这并不代表光学显微镜下观察到具有2PN及2PB的卵子被认为受精正常，其他情况就都为异常［1］。一些细胞和分子生物学研究［10-11］已经表明，某些在光学显微镜下观察判断为异常受精的胚胎实际上是正常的二倍体胚胎，即体外受精胚胎的原核数目观察可能对胚胎移植的价值做出错误判断。因此，在没有正常受精胚胎可供移植的情况下，可选择1PN或者0PN胚胎移植。目前已有移植1PN和0PN胚胎出生正常新生儿的报道［7，12-14］。

2 IPN及0PN的发生机制及研究进展

2.1 正常的受精过程及雌雄原核的形成 正常的受精过程包括一系列在时间上按先后顺序发生的事件的综合［1，15-17］。精子穿过透明带后，其胞膜与卵子胞膜融合，然后遗传物质进入卵子，此过程导致胞质释放Ca2+产生Ca2+波，从而激活卵子［18］。卵子的激活包括释放皮质颗粒［19］改变透明带内层结构避免多精受精等一系列分子反应。卵子激活后，第二次减数分裂恢复并排出含有单倍体母源遗传物质的第二极体［20］，亲本染色体去凝集及选择性的去甲基化［21］之后原核形成，其中雄原核在精子穿入点的卵膜下方形成并被母源核膜包被［15］，雌原核在第二极体分裂出来的正下方同时形成［22］。随后，在精子中心粒的星状体微管及微丝作用下，雌雄原核同时向卵子中央移动，直至两原核核膜解聚，双方染色体重组，即核融合形成二倍体胚胎［23-24］，并开始有丝分裂。

2.2 1PN发生机制及国内外研究进展 体外受精-胚胎移植周期中，1PN的发生率约为3% ～6%［8］。1PN的发生具体机制目前尚不明确，但单原核并不一定代表未受精。已有大量的研究［1］报道了1PN的细胞遗传分析结果，这些结果一定程度上阐明了1PN的形成机制。目前认为1PN可能的发生机制有以下方面。

2.2.1 孤雌激活(parthenogenesis):1PN2PB胚胎形成的主要机制之一是孤雌激活，其原核为母源的。人类卵子的孤雌激活率较低，激活刺激源可以是钙离子阻滞剂、蛋白激酶激活剂、电刺激和显微注射时的机械刺激。与常规IVF(conventional IVF，c-IVF)比较，ICSI的1PN胚胎更可能是由于孤雌激活所致。Feng等［25］发现，ICSI周期中的1PN胚胎多伴有染色体异常，仅有10%的胚胎含有Y染色体，表明ICSI中单原核胚胎可能是由于孤雌生殖而非受精形成。

2.2.2 精子染色体解聚异常:精子染色体解聚异常导致雄性原核不能形成，即卵母细胞已经被注入的精子激活，但是精子自身未形成原核，这也是1PN形成的主要原因之一，大约50%的ICSI-1PN是由于这一原因造成的［26］，这些胚胎表现为1PN2PB。

2.2.3 雌性原核形成异常:雌性原核形成异常也可导致1PN，例如ICSI中将精子注入减数分裂纺锤体中会影响第二极体排出，并抑制了雌性原核形成，可导致1PNlPB 卵子［27］。

2.2.4 雌雄原核融合:Levron等［6］推测某些1PN 为正常受精胚胎，但受精提前，雌雄两个原核已经融合为1个，或在未形成原核膜前就融合了，这样融合的单个原核可能要大些。

2.2.5 雌雄原核形成不同步(asynchronously):原核不同步发育也是形成1PN二倍体胚胎的原因。Payne等［22］通过实时录像记录ICSI后卵子的原核变化，发现38%(12/32)的受精卵子的原核发育是不同步的，如果在第一次观察后4～6 h再次观察原核情况，约25%的1PN卵子可见第2个原核［28］。

1PN来源的胚胎中单倍体和二倍体的发生率各文献报道不一，研究显示IVF-1PN卵子大约50%以上是二倍体，ICSI-1PN胚胎多为单倍体，只有不到30%的1PN卵子是正常二倍体［12，28-29］。有学者通过细胞遗传学方法发现，发生分裂的1PN胚胎中80%为二倍体，12% 为单倍体，7% 为三倍体［7］。另外，Feng［25］和Levron等［6］在研究中也发现，在 IVF周期中，50%的1PN受精卵都含有Y染色体，表明其不是孤雌激活形成的［6］，而分裂后形成的1PN胚胎经细胞遗传学检测，也发现通常为二倍体，提示受精正常。

ICSI-1PN与IVF-1PN的染色体组成有所不同。Catherine Staessen等［30］研究显示IVF-1PN来源的胚胎中48.7%为二倍体，ICSI-1PN来源的胚胎中27.9%为二倍体，提示 IVF-1PN胚胎的二倍体率高于 ICSI-1PN，作者认为导致这一现象的原因可能是部份卵子受精后原核形成不同步或是已经发生原核融合。Sultan等［7］报道ICSI-1PN来源的胚胎中9.5%为二倍体，66.7%为单倍体。

尽管国内外有不少数学者研究了1PN胚胎的非整倍体发生情况［31］，但对是否选择其进行移植一直是广大学者争论的焦点。有学者认为，1PN胚胎为伴有染色体异常的异常受精胚胎，不适合移植。含有单倍体遗传物质的胚胎一般不会继续发育或者发育不正常，即使将其进行移植，也多会发生流产、死胎、发育停止等。还有学者认为1PN来源胚胎发育潜能有限。Balakier等［32］在研究中发现，许多1PN胚胎质量较差，伴有碎片或者在2或8细胞阶段发育停滞，只有30%左右的胚胎发育至桑椹胚或者囊胚阶段，胚胎的囊胚形成率极低，故认为移植1PN来源胚胎没有临床意义，建议不移植。也有学者持相反意见，Katie Feenan 等［1］认为，部分 1PN 胚胎可培育至囊胚［14］，近年来有研究者从1PN胚胎成功地培育出了46，XX核型的人类胚胎干细胞系，以及1PN胚胎出生的健康新生儿［7，12-14］，以上几点支持了1PN胚胎作为无其他可选胚胎进行移植的情况下作为备选胚胎的可行性。

2.3 0PN发生机制及国内外研究进展 约30% ～40%的卵子体外受精18～20 h后显微镜下观察未见原核。未见到原核并不意味着未发生受精现象，继续观察后发现，部分0PN卵子仍会卵裂形成胚胎，其外观形态、卵裂率与正常受精胚胎相似。发生卵裂的原因可能是孤雌激活或者正常受精。IVF授精后可出现0PN的卵子，其中大约20%可发育成形态正常的胚胎［1］。

0PN的形成机制可能包括以下几个方面:①受精缺陷:最常见的发生原因是精子黏附和穿透机制的缺陷，或透明带受体的缺乏使精子的穿透受到抑制，精子不能穿入卵子内造成受精失败［14］;②正常受精，只是雌雄两原核发育不同步，原核提前融合而过早消失，或者原核形成延迟，导致镜下未见到原核。③Malcov等［5］通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)和多态标志分析发现4个0PN1PB胚胎中2个为二倍体双雌胚胎(digynic embryo)，其机制可能是第二极体未分裂出来，而是参与到核遗传物质的形成当中。

在临床实践中，因显微镜下观察时未见到原核，对0PN胚胎的染色体组成存在疑问，为了避免移植染色体异常胚胎而常将此类胚胎废弃，造成了胚胎的浪费。在患者无可选正常受精胚胎移植时，此类胚胎显得尤为重要。Manor等［6］采用FISH方法分析了23个0PN胚胎的 13、18、2l、X、Y 染色体的非整倍体性，发现57%(13/23)0PN胚胎为二倍体胚胎，提示为正常受精，将6个这样的胚胎移植给3个妇女，1例获得正常妊娠。

3 对1PN及0PN胚胎研究的趋势

从理论上讲，2PN胚胎为正常的二倍体核型，但有学者通过研究发现正常受精的分裂期胚胎中有25%～40%的染色体核型异常，卵裂期发育延缓的2PN胚胎染色体异常的发生率更高［33］。因此，对于0PN及1PN这类肉眼观察为异常受精的胚胎，可提高选择的标准，即选择发育速度及形态都正常者进行研究，以期最大程度的找出正常受精胚胎的所属范畴。

具有2PB是卵子完成第二次减数分裂的标志，比1PB卵子二倍体可能性更高［1］，2PB的存在可一定程度上排除二倍体双雌胚胎的移植。不同原核来源胚胎的染色体非整倍体发生率和非整倍体型的分布不同。如果能运用FISH等技术检测IVF-ET周期中，源于具有高受精风险患者的发育及形态良好1PN或0PN，且具有2PB胚胎的染色体非整倍体分布并判断其移植价值，则能更好的为临床上在无2PN正常受精胚胎移植的情况下，是否选择相应0PN和/或1PN胚胎移植，以及在存在有发育速度及状态良好的0PN和/或1PN胚胎时，是否将其冻存以保存患者生殖能力或继续培养提供理论依据，减少周期取消率，提高临床妊娠率，更好的为病人进行治疗。

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