血浆EBV-DNA与VCA-IgA联合检测对鼻咽癌诊断的意义

范国宇 刘伟

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国常见的恶性肿瘤，大多NPC患者就诊时已经出现颈部淋巴结转移甚至远处转移，尚缺乏有效的分子标志物［1］。大量资料显示EB病毒和鼻咽癌有密切关系［2］，鼻咽癌患者外周血中存在多种EB病毒的相关抗原、抗体，长期以来，检测EB病毒壳抗原IgA抗体(VCA-IgA)是鼻咽癌诊断的主要辅助指标，但因其假阳性较高，为鼻咽癌的早期诊断带来一定困难［3］，近年来发现血浆EBV-DNA水平是一种可靠的监测指标［4］，血浆EBVDNA水平与体内肿瘤负荷呈正相关［5］。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2005年12月至2010年9月于我院确诊为鼻咽癌患者88例，所有患者初诊时均经病理学诊断为鳞癌，其中男57例，女31例，年龄24～68岁，中位年龄45岁。同期行健康体检者45例作为对照组，男30例，女15例，年龄36～70岁，中位年龄50岁，排除患有肿瘤性疾病。

1.2 临床分期 根据1992年全国鼻咽癌福州会议推荐的分期［6］。早期鼻咽癌患者38例，其中Ⅰ期21例、Ⅱ期17例，晚期鼻咽癌患者50例，其中Ⅲ期28例、Ⅳ期22例。

1.3 标本收集和实验室检查 ①EVB-DNA荧光定量PCR试剂盒购自深圳达安生物技术公司，荧光定量PCR仪为MJ公司OPTICON2型，每个研究对象空腹抽取外周静脉血2 ml，加入EDTA抗凝管中，1600 g离心后分离上层血浆，置于-20℃冻存。每份血浆标本取50 μl用QIAamp Blood Kit试剂盒抽取血浆DNA。血浆中EVB-DNA含量计算如下:C:EVBDNA拷贝数(ml);Q:PCR扩增后计算机检测的原始DNA拷贝数;VDNA:抽取的DNA稀释液体积;VPCR:用于PCR扩增的DNA体积;Vext:用于抽取DNA的血浆体积;公式:C(ml)=Q(VDNA/VPCR)(1/Vext)［7］。血浆 EVB-DNA含量结果大于0 copies/ml为阳性。②常规的免疫酶法检测血浆VCA-IgA，滴度大于1∶40为阳性。

1.4 统计学方法 所有实验数据应用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度检测结果 鼻咽癌患者EVB-DNA水平检出阳性率81.82%，阴性率18.18%，中位拷贝数3.8×103copies/ml(3.9×102～6.1×104copies/ml)。健康对照组EVB-DNA水平检出阳性率6.67%，阴性率93.33%，中位拷贝数0 copies/ml(0-58 copies/ml)，两组阳性率差异有统计学意义(u检验，u=10.24，P＜0.01)，鼻咽癌患者血浆VCA-IgA滴度检出阳性率89.77%，阴性率10.23%，健康对照组血浆VCA-IgA滴度检出阳性率31.11%，阴性率68.89%，两组阳性率差异有统计学意义(u检验，u=7.06，P＜0.01)。

2.2 NPC患者不同临床分期血浆EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度检测结果 比较鼻咽癌患者不同TNM分期的血浆EVBDNA水平检测结果，Ⅰ期与Ⅱ期之间没有统计学差异(P=0.72)，与Ⅲ期、IV期之间有统计学差异(F=3.41，P=0.016)，Ⅱ期与Ⅲ期、IV期之间有统计学差异(F=4.12，P=0.008)，Ⅲ期与IV期之间没有统计学差异(P=0.65);比较鼻咽癌患者不同TNM分期的血浆VCA-IgA滴度检测结果，Ⅰ期与Ⅱ期之间没有统计学差异(P=0.76)，与Ⅲ期、IV期之间有统计学差异(χ2=15.6，P=0.004)，Ⅱ期与Ⅲ期、IV期之间有统计学差异(χ2=7.64，P=0.048)，Ⅲ期与IV期之间没有统计学差异(P=0.93)。晚期鼻咽癌患者EVB-DNA中位拷贝数与早期比较，III、IV期患者血浆EVB-DNA中位拷贝数是Ⅰ期、Ⅱ期患者的6倍(P=0.001)，有显著差异。

2.3 血浆EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度的关系 88例鼻咽癌患者中，有16例患者未检测出EVB-DNA，其VCA-IgA均为阳性，滴度≥1:40，其中12例滴度≥1:20，有9例患者未检测出VCA-IgA，其中8例检出 EVB-DNA，中位拷贝数1.8×102copies/ml(31～2.3×103copies/ml)，只有1例阴性。45例对照组中，有3例检测出EVB-DNA，中位拷贝数0 copies/ml(0～30 copies/ml)，有1例VCA-IgA阳性，滴度为1∶20。

3 讨论

鼻咽癌的特点是恶性程度高，有些患者在鼻咽镜检查尚未发现原发灶时，就有淋巴结转移。Cannon等报道约73%的患者有误诊或延误，内镜技术为鼻咽部检查提供了直观、放大图像，但是难以发现黏膜下肿瘤，敏感性只有62%［8］。患者外周血中存在多种EB病毒相关的抗原、抗体，早期多采用血浆VCA-IgA作为筛查以及评价鼻咽癌治疗效果的血液学指标，由于抗体水平的变化落后于患者体内EBV病毒的变化，不能灵敏的反应肿瘤消长变化。近年来大量资料显示血浆EVB-DNA与鼻咽癌关系密切，其水平可以反映肿瘤的负荷，与肿瘤的恶性程度有正比关系。本组研究显示，鼻咽癌患者组EVB-DNA的检出阳性率为81.82%，健康对照组阳性率为6.67%，前者中位拷贝数3.8×103copies/ml，后者中位拷贝数0 copies/ml，鼻咽癌患者的阳性率显著高于对照组，进一步证实了鼻咽癌与EB病毒的关系。在鼻咽癌患者组的临床分期中，阳性率也有差异，主要表现为Ⅰ期、Ⅱ期患者的阳性率及中位拷贝数均低于Ⅲ期、IV期患者，说明EBV-DNA水平与患者体内肿瘤负荷呈正相关，可能是由于血浆EBV-DNA由肿瘤细胞释放入外周血的结果。本研究还应用常规的免疫酶法检测了血浆VCA-IgA滴度，鼻咽癌患者血浆VCA-IgA阳性率为89.77%，对照组31.11%，两组有显著差异，79例血浆VCA-IgA阳性患者中，其抗体滴度均≥1:20，88例患者中，有16例患者未检测出EVB-DNA，其VCA-IgA均为阳性，滴度≥1:40，其中12例滴度≥1:20，进一步证实了血浆VCA-IgA的诊断价值，说明这两种检测方法对鼻咽癌的诊断具有互补作用，符合相关研究的结论。综上，同时检测外周血EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度，对于鼻咽癌患者的诊断有极高价值，该方法经济有效，适用于门诊及病房对鼻咽癌疑诊患者的筛查，对已确诊的患者病情进行评估，可作为监测病情的一种有效手段。

［1］Zhang Z，Sun D，Van do N，et al.Inactivation of RASSF2A by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma.Int J Cancer，2007，120(1):32-38.

［2］Lo KW，To KF，Huang DP.Focus on nasopharyngeal carcinoma.Cancer cell，2004，5(5):423-428.

［3］贾卫华，曾益新.鼻咽癌易感基因的研究.实用肿瘤杂志，2004，19(4):270-273.

［4］向燕群，郭翔，闵华庆.鼻咽癌分子标志物研究进展.实用肿瘤杂志，2004，19(4):273-275.

［5］季明芳，郭媛卿，梁锦胜，等.鼻咽癌患者发病前后EB病毒VCA/IgA和EA/IgA滴度动态分析.中华肿瘤杂志，2003，25(3):243.

［6］Lin JC，Wang WY，Chen KY，et al.Quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma.N Engl J Med，2004，350(6):2461.

［7］To EWH，Chan KCA，Leung SF，et al.Rapid clearance of plasma Epstein-Barr virus DNA after surgical treatment of nasopharyngeal carcinoma.Clin Cancer Res，2003，9(8):3254.

［8］Lo YM，Chan IY，Lo KW，et al.Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patiets with nasopharyngeal carcinoma.Cancer Res，1999，59:1188-1191.