脂肪间充质干细胞与HGF在胃溃疡治疗中的作用

陈志锋 黄聪武

·综述·

脂肪间充质干细胞与HGF在胃溃疡治疗中的作用

陈志锋 黄聪武

消化性溃疡(peptic ulcer，PU)是全球性常见病，其高复发率仍是当前PU治疗中的一大难题。而脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cell，ADSC)具有多向分化能力，以及分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等生长因子的特性。因此，利用ADSC移植治疗胃溃疡，或可增强胃溃疡患者的胃黏膜屏障，有望成为一种新颖的治疗手段。本文就PU的治疗现状、ADSC和HGF的生物学特性、ADSC和HGF的相关研究进展作一综述。

脂肪间充质干细胞;肝细胞生长因子;胃溃疡;移植;基因转染

消化性溃疡(peptic ulcer，PU)主要指发生在胃和十二指肠的慢性溃疡，即胃溃疡(gastric ulcer，GU)和十二指肠溃疡(duodenal ulcer，DU)，是一种临床上常见的慢性胃肠道疾病。由于抑制胃酸药物、保护胃黏膜药物、根除幽门螺杆菌药物的使用，PU发病率已呈下降趋势，有效治愈率明显提高，但如何降低PU的复发率，仍是当前PU治疗中的一大难题。近几十年来，随着成体间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的发现，以及其具有的多向分化能力，让人们看到了利用MSC分化为胃黏膜上皮细胞以改善胃黏膜防御-修复屏障和炎症反应，从而治疗GU并防止其复发的可能性。脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cell，ADSC)作为其中一种MSC，具有细胞数量大、取材创伤性小、可向胃黏膜上皮细胞分化、无免疫排斥反应等优点。利用ADSC移植治疗GU，有可能会成为一种新颖的治疗手段。本文现对PU的治疗现状、ADSC和HGF的生物学特性、ADSC和HGF相关的研究进展作一综述。

1 消化性溃疡的治疗现状

自从1910年Schwartz提出了“无酸无溃疡”的观点后，胃酸就一直是在探讨消化性溃疡发病机制和治疗措施时需要考虑的重点因素。H2受体拮抗剂(H2-Receptor Antagonist，H2RA)和质子泵抑制剂(Proton Pump Inhibitor，PPI)的广泛应用及明显疗效也进一步确证了胃酸在溃疡形成过程中的重要作用。而自从1982年幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，HP)被发现并证明其与PU的发生有密切关系，更是消化性溃疡治疗的一个里程碑。由于根除HP的意识的建立，以及PPI或胶体铋为基础加上抗HP感染药物的联合疗法的出现，PU的治愈率达到了一个新的高度。但是PU的高复发率，至今仍是困扰着临床医师的一大难题。

PU的复发与多种因素有关:①在抑酸治疗过程中骤然停药会出现反跳性分泌从而导致溃疡复发。②HP耐药菌株的出现，使得传统的抗HP治疗方案的HP根除率有所下降;而HP的高再感染率，亦使更多的患者HP根治失败。③非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)的持续应用，吸烟、酗酒、高盐饮食等不良生活方式，工作、精神压力增加所带来的情绪应激，均可削弱胃黏膜的防御-修复功能，致使胃黏膜屏障受损并影响溃疡愈合。因此溃疡患者尤其是GU患者一旦合并上述危险因素，复发率也就会相应增加。

除了改进抗HP治疗方案以提高HP根除率外，许多学者亦致力于寻求新的治疗方式来治疗PU并防止其复发。目前通过提高溃疡愈合质量(quality of ulcer healing，QOUH)来防止PU复发的观点正日益受到重视，也出现了众多以提高溃疡愈合质量为目的的治疗思路和方法，如应用胃黏膜保护剂保护黏膜屏障、改善黏膜局部血液循环、利用细胞生长因子修复损伤黏膜等。而自从MSC被发现以来，其具有的多向分化潜能就一直受到研究人员的关注，并被广泛应用在组织工程学、细胞治疗和基因治疗等方面。通过移植MSC来修复损伤的胃黏膜上皮组织，或可恢复黏膜原有的防御屏障功能并提高溃疡愈合质量，从而达到治疗GU并防止其复发的目的。既往国外有研究采用骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stem cell，BDSC)治疗GU并取得了令人鼓舞的结果，证实了BDSC与胃黏膜的再生密切相关，通过移植BDSC可加速溃疡的愈合［1］。然而，由于BDSC的数量很少，并且获取骨髓组织时创伤性大，这使得BDSC的临床应用前景受到了限制。因此，有学者一直致力于寻求具有良好临床应用前景、能用于组织工程或细胞治疗的新的干细胞来源。脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cell，ADSC)同样作为具有多向分化潜能的细胞，相比较BDSC而言有着提取方法简单、细胞数量大、取材创伤性小等优点，因而在组织重建与修复、细胞治疗等多方向的研究中显示出广泛的应用前景和极高的科研价值。

2 ADSC的生物学特性

ADSC可从脂肪抽吸物、腹股沟脂肪垫或髌骨下脂肪垫中分离得到。一次脂肪抽吸术约可吸取200 ml脂肪抽吸物，其中可产生约1×106个ADSC，而局部麻醉下行骨髓穿刺术一般最多只能抽出约40 ml骨髓，其中包括约2.4×104个MSC，即通过分离脂肪获得的间充质干细胞的量是骨髓分离获得量的40倍。由此可见，与其他来源的间充质干细胞比较，ADSC具有可大量获取、提取方法简单且对供区损伤不大的独特优势。

ADSC在加有任何批号胎牛血清的培养基中均能很好的扩增，这点不同于BDSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求。在传代培养中，平均倍增时间为60 h且能保持稳定的倍增率直至13～15代，其中衰老和死亡细胞的所占比例也很少。这说明ADSC的体外扩增能力很强，通过传代培养可获得大量有分化能力的细胞。

ADSC和BDSC无论是形态学上的外形抑或是所表达的细胞表面标志物均很相似;CD105、Stro-1、CD166是确定细胞多向分化能力的常见细胞表面标志物，在ADSC和BDSC中均有表达［2，3］。ADSC和BDSC还表达CD29(主要在血管形成方面发挥作用)和CD44(在细胞外基质形成方面发挥作用)。ADSC和BDSC均不表达CD31、CD34、CD45，提示其可能没有造血干细胞特性［4］。只有不到1%的ADSC表达HLADR，大部分表达MHC I型分子，提示ADSC具有免疫逃逸特性，可以进行异体移植［5］。

由于ADSC和MSC具有无论在形态上还是在细胞表面标志物上都具有大量的相似性，且目前尚未发现ADSC的特异性细胞表面标志物，ADSC曾一度被怀疑仅仅是位于脂肪组织中的MSC家族，有可能是血液中的MSC通过周围血管组织向脂肪组织的渗透。也有观点认为ADSC可能由多种异源性细胞构成，包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞及前体脂肪细胞等。但通过免疫荧光和流式细胞仪检测可以发现两者间的区别:ADSC表达CD49 d，不表达CD106;MSC则相反［6］。目前认为造成这种区别的原因可能与细胞存在的微环境和细胞的具体功能有关，如CD106在MSC和造血干细胞(haemopoietic stem cell，HSC)相互作用中(即HSC的归巢和动员过程中)起重要作用，而ADSC不表达CD106则与其处于非造血组织的特点相一致。这证实了脂肪组织中存在的ADSC不同于在骨髓中发现的MSC。而间充质干细胞与成体细胞最大的区别在于间充质干细胞具有向不同的间质组织多向分化的能力，因此进行多系定向诱导来证明其多向分化能力是鉴定ADSC的一个较好的方法。目前已有许多研究证实了ADSC在不同培养基的条件下能够向中胚层细胞系包括脂肪、软骨、骨、肌细胞和其他胚层细胞系包括神经、内皮、心肌细胞等转化［7］。这有力的说明了ADSC是真正意义上的具有多向分化潜能的干细胞，而不是多种异源性细胞的简单混杂。

3 HGF的生物学特性

MSC在培养过程中可分泌HGF、VEGF等生长因子，而HGF(肝细胞生长因子，hepatocyte growth factor，HGF)作为一种多效性细胞因子，其在器官形成、组织修复、血管再生等方面中早已被证实具有重要的作用，尤其是胃黏膜组织所分泌的HGF对维持黏膜上皮细胞形态及功能、促进毛细血管增生等方面的作用更是明显［8］。而ADSC也同样被证实了可分泌HGF、VEGF等生长因子［9］，因此利用ADSC移植治疗GU的过程中，ADSC及其分泌的HGF或可在改善黏膜溃疡、提高胃壁厚度等方面起到协同作用。

HGF在溃疡黏膜修复中主要参与了上皮重建和上皮细胞分裂增殖这两个过程。正常胃黏膜下的黏膜下层、肌层、浆膜层即有HGF基因转录，NSAID诱导的急性黏膜损伤时HGF mRNA表达增多，在醋酸诱导的胃溃疡边缘也发现了HGF基因的高表达［10］。HGF在促进损伤黏膜残存细胞迁移移植的同时还可诱导上皮细胞分化成胃肠腺管状结构。HGF还能够抑制肝、心、肺等纤维化组织中转化生长因子-β1(transfor-ming growth factor-β1，TGF-β1)的产生和增强胶原酶的活性［11］。这说明HGF在刺激胃黏膜上皮和溃疡面微血管内皮的增殖、运动，加速溃疡的愈合的同时，还可能抑制胶原的合成和沉积，减少愈合后的溃疡瘢痕，有利于防治溃疡瘢痕性幽门梗阻的发生，改善GU的预后。由此可见HGF在GU的治疗过程中所扮演的角色的重要性。

4 ADSC与HGF的相关研究进展

尽管已经证实了ADSC和MSC一样具有多向分化潜能，但是目前关于ADSC向上皮细胞分化的研究仍不多。2005年Brzoska等［12］在体外成功诱导了ADSC向上皮细胞的分化。2007年Paunescu等［13］的研究则发现HGF是促使MSC向上皮细胞分化的重要因子之一。可以预期，通过移植ADSC进入受损的胃黏膜中，除了ADSC本身可能向胃黏膜上皮细胞分化外，其分泌的HGF亦在ADSC的上皮分化过程中起到一定的诱导作用，从而达到创面修复和黏膜下组织重建的目的。

Cai等［14］的研究发现抑制HGF的表达会降低ADSC促进缺血组织血管再生的能力，提示HGF是影响ADSC治疗效果的关键因素。Okada等［15］的研究发现MSC移植可促进血管生成并抑制炎症因子的产生，且这些变化与HGF的表达增加有关。近年来有观点认为应当关注MSC在低氧状态下的组织修复作用，因为当MSC被作为治疗工具移植用于组织修复时，其周围环境的氧含量会从体外培养的21%转至缺血组织的不足1%，且在生理条件下，MSC在骨髓或其他部位，其生长、增殖环境均为低氧分压。相关研究［16］发现，缺血肌肉的HGF表达增多，低氧可诱导MSC表面c-Met受体的表达，经低氧预处理的MSC更容易移植并发挥更大的组织修复作用。可见，在利用ADSC移植治疗GU的过程中，HGF的表达量以及其生物学作用是否能充分发挥，与ADSC是否能顺利分化并发挥疗效息息相关。

目前尚未有诱导ADSC向胃黏膜上皮细胞分化以治疗GU的研究报道。但ADSC表现出的多向分化潜能及可向上皮细胞分化的特性，提示其移植于受损的溃疡创面后，可能会起到修复受损的胃黏膜上皮组织，恢复其防御屏障功能并提高溃疡愈合质量的重要作用。而ADSC分泌的HGF亦可与ADSC协同作用，在促使ADSC向胃黏膜上皮细胞分化的同时，刺激血管内皮细胞的迁移、增殖，形成新生血管，增加黏膜血供，并抑制炎症反应和减少纤维组织增生，从而促进溃疡愈合。近年来，随着基因转染技术的日益发展，通过构建HGF质粒转染ADSC来移植治疗GU或可使ADSC和HGF在溃疡创面修复中的协同作用得到充分发挥。由于MSC具有免疫逃逸特性，其一直被认为是理想的组织工程和基因载体细胞。经过HGF基因修饰的MSC能持续稳定的表达HGF并作用于溃疡创面，克服了HGF半衰期短的缺点;HGF可抑制细胞凋亡的特性亦可使载体干细胞长时间存活在创面，从而更有利于其分化为胃黏膜上皮细胞;HGF抑制TGF-β1的产生和增强胶原酶活性的特性也促使ADSC刺激形成的多余胶原得到有效降解，减少溃疡愈合后的瘢痕。目前已有研究采用经HGF修饰的MSC进行移植治疗，并明确了其在组织修复再生方面的疗效［17］。而ADSC亦是一种理想的基因载体。Zhu等［18］通过慢病毒介导转染HGF至ADSC，并将转染后的ADSC用于移植治疗急性心肌梗死，结果发现转染后的ADSC通过促进血管生成、抑制心肌纤维化而改善左室功能，且HGF增强了血管生成和抗纤维化的效果。由此可见，利用HGF转染ADSC移植治疗GU，是值得期待的一种治疗手段。

虽然现阶段已有大量ADSC的相关研究，但是仍有问题等待解决:①目前尚未建立起ADSC的鉴定筛选标准:现有的各个实验研究在分离培养ADSC的过程中，在脂肪组织取材部位、采用的胶原酶类型、消化时间均有所差异，故无法排除由于实验条件不同所获得的ADSC存在差异的可能性;且分离获得的细胞群虽然主要组分是ADSC，但仍有可能混杂低水平的造血细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞(pericyte)。因此寻找到ADSC的特异性标志物，制定标准的分离、培养和纯化方法对其的临床应用具有重要意义。②诱导ADSC向各类型细胞分化的信号种类、分子机制、基因调控方式尚不明确:目前ADSC的体外诱导多是在诱导培养基中加入不同的生长因子或化学物质等促进其向不同类型的细胞分化，这些诱导剂发挥作用的机制、诱导剂间的相互作用、最佳效量比和序贯应用的方法等问题尚无明确答案。因此要将ADSC运用于组织工程，有必要对ADSC的多向分化，尤其对其分化能力、生长因子及潜在的信号调控机制作进一步研究。③体外培养的ADSC，最终要移入体内进行研究，所以ADSC在体内诱导分化的条件、选择合适的动物模型、种子细胞移入体内所需的合适载体仍有待探寻。

尽管如此，ADSC的多向分化能力、免疫原性弱、可分泌HGF等生长因子协同发挥组织修复作用等特性，以及其相比较BDSC具有提取方法简单、细胞数量大、取材创伤性小等优点，使其在组织工程、基因治疗、细胞移植等多方向的研究中显示出独特的优势。有理由相信随着研究的逐渐深入，利用ADSC移植治疗GU，有望成为一种新颖的治疗手段，并显示出广泛的临床应用前景和极高的科研价值。

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Roles of adipose-derived stem cells and hepatocyte growth factor in the treatment of gastric ulcer

CHEN Zhi-feng，HUANG Cong-wu.Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Shantou U-niversity Medical College，Shantou 515041，China

Peptic ulcer is one of the world's most common ailments，and the high recurrence rate remains a major problem following the treatment of peptic ulcer.Adipose-derived stem cells(ADSCs)have multiple differentiation ability and secrete growth factors such as hepatocyte growth factor(HGF)and vascular endothelial growth factor(VEGF).Therefore，transplantation of ADSCs may strengthen the gastric mucosal barrier in gastric ulcer patients，and this may become a potential new therapy for gastric ulcer.This article reviews the current status of treatment of peptic ulcer，the characteristics of ADSCs and HGF，and the recent advances in ADSCs and HGF．

Adipose derived stem cell;Hepatocyte growth factor;Gastric ulcer;Transplantation; Gene transfection

515041汕头大学医学院第二附属医院消化内科

黄聪武E-mail:huangcw9988@yahoo.com.cn