抑癌基因的活性检测在人体衰老评估中的意义

汤世坤 林雄斌※

癌症是一种典型的年龄相关性疾病，多发生在人生的老龄阶段［1］。调查显示，癌症已经成为严重危害我国人民健康的大敌，其导致的死亡率在我国名列首位。近年来，随着分子生物学的快速发展，人们对癌症发生的分子机制研究有了重大突破。在对衰老和癌症的研究中，人们发现在各种环境和遗传因素的作用下，癌基因活化，细胞凋亡调节改变，发生转分化导致肿瘤的发生。研究表明肿瘤发生与机体衰老密切相关，并随着年龄的增长而增加［2，3］。衰老细胞随着增龄而积累，产生胞外基质重构酶、炎性细胞因子及上皮生长因子等，破坏局部组织微环境、刺激邻近细胞增殖和恶性进展，进而促进和加速肿瘤的发生［4，5］。而肿瘤反过来可以导致异常的DNA复制，造成DNA损伤，诱导细胞衰老［6］。研究发现癌基因并不是导致机体致癌的唯一条件，在对癌细胞进行系统分析时发现只有当这些细胞某些染色体位点发生缺失或突变，肿瘤才会形成，这些缺失或突变的位点称为抑癌基因。

抑癌基因是一类原本就存在于正常细胞中，可以抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因的丢失或失活可能导致肿瘤发生，加速人体衰老死亡进程。因此，抑癌基因可能是与肿瘤和衰老调节相关联的关键基因。这里，我们关注的是目前抑癌基因在衰老和肿瘤中的作用，并且讨论抑癌基因活性的检测在判断人体衰老、检验癌症的发生发展的重大潜力和深远意义。

1.衰老与肿瘤形成

肿瘤由于其严重的社会危害性，受到人们的普遍关注。目前，肿瘤一般被认为是失控的细胞增殖，但在很多肿瘤的早期阶段，癌基因的表达与细胞衰老有关。Fabrizio等的研究表明，被激发的致癌基因能引起异常的DNA复制，从而引起DNA损伤，后者又能导致细胞衰老［6］。细胞衰老以前被发现在活体中是肿瘤形成的一个障碍，研究显示，细胞除了可以通过凋亡或自杀来抑制肿瘤形成外，还可以通过衰老阻止细胞分裂，进而抑制肿瘤［7］，所以由致癌基因诱导的细胞衰老可能是对癌症的一种先天性防御。但其效果却经常因进一步突变而丧失，大量证据表明，随着癌症的发展，活化的癌基因可以诱导产生细胞衰老，进而加速机体的衰老进程［8，9］，所以衰老与肿瘤形成是一个复杂而多层次的关系。

2.抑癌基因与衰老

肿瘤的发生是一个十分复杂的生物学过程，主要涉及各种因素导致的癌基因活化与抑癌基因失活，从而引起基因表达异常，导致肿瘤的发生。通常认为抑癌基因的突变和失活与肿瘤的发生有着非常密切的关系。鉴于衰老与肿瘤发生、抑癌基因与肿瘤发生的密切关系，探讨抑癌基因对于理解衰老很有必要。

抑癌基因的发现较癌基因晚，目前已经确定的抑癌基因有30多种，其编码的产物广泛分布于细胞各个部分，功能多种多样，其中与细胞衰老相关的主要包括:转录调节因子，如Rb、P53;负调控转录因子，如WT-1;周期蛋白依赖性激酶抑制因子，如P15、P16、P21;信号通路的抑制因子，如 PTEN;与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分，如APC等。

2.1 转录调节因子

2.1.1 Rb Rb基因是人类发现的第一种抑癌基因，最早见于儿童的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)。当Rb基因丧失功能或先天性缺乏，视网膜母细胞则出现异常增殖，形成视网膜母细胞瘤［10，11］。

人类Rb基因包含有27个外显子，26个内含子，定位于第13号染色体的q14区域，DNA全长178143bp，mRNA全长4772bp，编码928个氨基酸。Rb所编码的蛋白pRb是一个位于细胞核的磷蛋白，相对分子量约105kDa。Rb基因在多种正常细胞中都能表达，而且随着细胞周期的进行没有明显变化，但是其表达量在不同组织和不同发育阶段有一定的差异［12，13］。Rb基因对抑制多种肿瘤的发生发挥着不可或缺的作用，如视网膜母细胞瘤、食管癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤和乳房癌等多种肿瘤中发现Rb基因的突变及表达缺失［14］。大量研究表明，Rb的抑癌作用与其对细胞周期、细胞分化、细胞衰老、细胞凋亡和生长抑制等的调控是密切相关的，是细胞周期重要的调节因子。Rb基因对肿瘤的抑制作用与转录因子(E-2F)有关。E-2F是一类转录活化因子，是细胞从G1期进入S期的决定因子。在细胞G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白与E-2F结合成复合物，使E-2F处于非活化状态，抑制细胞增殖;在S期，Rb蛋白被磷酸化而与E-2F解离，结合状态的E-2F变成游离状态，细胞立即进入增殖阶段。当Rb活性降低或基因突变，丧失结合、抑制E-2F的能力，于是细胞增殖活跃，导致肿瘤发生［15］。

2.1.2 P53 P53是目前公认的的最为重要的抑癌基因，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等过程中起到了重要的作用，被认为是影响人类寿命的一个基因［16］。P53基因在抑制肿瘤发展的进程中扮演着重要的角色，人类50%以上肿瘤中P53基因出现缺失或突变，是肿瘤中最为常见的遗传学改变［17］。

P53最初发现于转化的SV40细胞，在早期的实验中许多转化的细胞或者肿瘤细胞系中均伴随着P53蛋白的增加，而且导入P53基因能使细胞获得永生性，因而P53被归为癌基因。但后来发现，所有转化细胞和肿瘤细胞所表达的P53均为其突变形式，突变了的P53的量显著高于与细胞内正常P53，进而阻止正常基因发挥作用，因此将其划入抑癌基因［18］。

P53基因是位于人类17号染色体短臂上的一个单拷贝基因，基因全长20kb，由11个外显子和10个内含子组成，编码一个含有393个氨基酸的蛋白质，分子量为53kD。正常组织或细胞中的P53蛋白半衰期很短(6～20分钟)，含量极少，而当受到辐射或其他能导致DNA损伤的因素都能大幅度提高细胞内P53的表达量。P53活化对细胞有两种潜在的影响:一是使细胞停滞于G1期，阻止细胞进入S期，抑制细胞生长;二是诱发细胞凋亡，去除变异细胞。但P53的抑癌功能则因突变而失活，使细胞无限分裂增殖，导致癌症的发生［19，20］。

2.2 负调控转录因子(WT-1)

WT-1基因作为抑癌基因是在肾Wilm肿瘤中发现的，主要参与细胞生长调控，它被认为是和发育有关的基因。研究发现WT-1在肾、脾、脑、脊髓、睾丸、卵巢、子宫等都有表达。WT-1基因的表达在时间和空间上都有严格的调控，如果在胚胎性发育时表达下调、缺失或突变可导致多种异常的发生，如肾Wilm瘤、泌尿生殖器的畸形、精神发育滞后等［21］。

2.3 周期蛋白依赖性激酶抑制因子

2.3.1 P16 P16基因又称多肿瘤抑制基因、INK4a抑癌基因，是一种直接作用于细胞周期的抑癌基因，其编码蛋白在细胞周期调控中起着十分重要的作用，研究显示P16编码的蛋白在超过30%的人类肿瘤中失活。

P16定位于人类9号染色体，基因全长8.5kb，包含2个内含子和3个外显子，编码一个由148个氨基酸构成的16kD蛋白质。P16蛋白是一种CDK4抑制因子，在正常细胞中起负反馈调节作用。研究发现细胞衰老时，P16表达升高，抑制细胞分裂，从而维持衰老细胞不可逆的生长停滞状态。在细胞增殖周期中，P16可特异性与CDK4/6结合，抑制CDK4/6对pRb的磷酸化激酶活性而使pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态，从而抑制细胞生长和分化。当P16基因表达下调、突变或缺失时，CDK4/6与Cyclin D结合，刺激细胞分裂，引起细胞过度增殖，导致肿瘤发生［22］。

2.3.2 P15 P15基因是继P16基因后发现的又一INK4系列抑癌基因，两者在结构和功能上具有很高的相似性。P15基因也被称为多肿瘤抑制基因2，定位于人类9号染色体上。P15与P16一样，它的主要作用是抑制CDK4/6活性，P15蛋白对CDK4/6有高度亲和性，在细胞增殖的调控中，P15蛋白与cyclin D1竞争和CDK4/6结合形成二聚体，发挥负性调节作用，使细胞周期蛋白与CDKs分离，从而使细胞发育停滞。近年来，P15基因在各项研究在不断深入，其表达在许多肿瘤中都表达异常，提示P15基因在多种肿瘤的发生、发展中起着较为重要的作用［23，24］。

2.3.3 P21 作为抑癌基因，P21是细胞周期重要调控因子CKD中的一员，它能够抑制CyclinD/cdk4的活性，使pRb去磷酸化，从而使细胞周期停滞于G1期，同时，P21也能抑制PCNA活性从而影响DNA复制。P21的表达下降或缺失时，其抑制细胞增殖的作用减弱，细胞正常增生转变为增生分化不良，可能导致肿瘤发生。在细胞发育周期中，如DNA损伤发生在G1期，P21可通过抑制CDK的活性而阻碍细胞进入S期，如DNA损伤发生在S期，P21则可通过使PCNA失活而停止DNA的合成，从而使细胞修复。许多研究表明，P21与肿瘤的分化、增生、转移有关，Deiry等发现P21对肺腺癌细胞、脑肿瘤细胞和结肠癌细胞的生长具有明显的抑制作用［25］，而战雪梅和Stefanaki等研究发现食管癌和肺癌中P21也存在低表达现象［26，27］。

2.4 信号通路的抑制因子(PTEN)

PTEN是迄今发现的唯一一种具有磷酸酶活性和蛋白酯酶活性双特异性的肿瘤抑制基因，其在细胞生长发育和细胞凋亡、细胞迁移及肿瘤发生发展的调控中发挥重要作用。

PTEN基因位于人类10号染色体上，全长200kb，分子量为47kD，包括9个外显子和8个内含子，编码由403个氨基酸组成的蛋白质。PTEN蛋白分布广泛，但不同组织中PTEN浓度不同，细胞中分布部位不同，功能也不尽相同［28］。

鉴于PTEN广泛的抑癌作用，研究者们对其抑癌途径进行了深入的研究，发现它的主要几条途径如下。PI3K途径:PTEN蛋白可使PPIP3去磷酸化，阻断PI3K/AKT信号传导通路，对PI3K/AKT信号传导起负调控作用，从而降低PIP3水平，使细胞停滞于G1期，起到抑制肿瘤细胞生成的作用［29］;MAPK途径:PTEN蛋白能够抑制MAPK激酶的磷酸化，同时还能够抑制MAPK途径上游的ERK、RAS的活化和Shc的磷酸化，对细胞生长进行负调节，从而阻止细胞生长、促进细胞凋亡［30］;FAK途径:FAK是整合素信号传导途径中的关键因子，主要介导细胞转移、扩散和黏附，PTEN通过其磷酸酶活性调节FAK的磷酸化，使FAK去磷酸化而失活，从而影响细胞的迁移、黏附，达到抑制肿瘤的增殖、转移和扩散［31］。

2.5 与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分(APC)

APC基因作为一个抑癌基因，分布于全身多处组织器官中，主要参与调节细胞生长和自身稳定。它直接参与Wnt的信号传导途径，正常APC蛋白与Axin、GsK-3β形成复合物保证Wnt信号途径对细胞分化、增殖、极性以及迁移的正常调节;APC基因突变或缺失后不能正常地发挥生理功能，导致细胞黏附、生长、分化、增殖、凋亡调控和细胞内信号等方面的重要改变，使细胞发生癌变［32］。

3.结语

随着有关抑癌基因与癌症、衰老相关研究的不断深入，癌症与衰老的相互关系日趋明朗，越来越多的抑癌基因将会被发现，有关抑癌基因与癌症和衰老之间的关系亦将越来越清晰。众所周知，细胞衰老是机体衰老的基本单位，也是人类老年相关疾病发生的基础。衰老和肿瘤的关系密切，Rb、P53、P16、P33等抑癌基因是细胞衰老和肿瘤发生的关键效应物，是细胞衰老遗传控制程序中的主要环节，因此，对衰老细胞中Rb、P53、P16、P33等抑癌基因进行活性检测将有助于对老年病和肿瘤等疾病的发生、发展有更好的了解，有助于对肿瘤和细胞衰老的筛查和诊断，为我们及时有效的预防癌症、治疗癌症、对抗衰老带来新的希望。

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