体外热原检测法-人外周血单个核细胞法研究综述

卢金凤，蒲旭峰，闵志强，李亚丽，杨奎

自百年前出现注射用药至今，非肠道用医用制品中的热原对人体的危害已经人所共知，临床表现如下：发热，寒颤，恶心，呕吐，头痛，腰及关节痛，肤色灰白，白细胞下降，血管通透性增强，严重者造成昏迷甚至休克，死亡。因此要求非肠道使用制品包括药品、生物制品（包括基因工程产品和基因治疗相关产品）和医疗器械装置（体内用）都应进行热原检测，有效地对其热原进行控制和检查是临床上安全使用的重要保证。通过使用健康人体全血分离得到的人外周血单个核细胞（PBMC）进行热原检测，可真实地模拟机体对热原的反应，更好的保证了制剂的安全性。

1 热原本质

到目前为止国内外对热原的定义还没有一个统一的认识[1]，一般认为热原是指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。引起机体致热反应的物质称为热原质[2]。热原的本质特征是造成机体发热。主要分为两大类：

（1）外源性热原:微生物来源：细菌（内毒素），病毒，蛋白，热体蛋白等非微生物来源：抗原-抗体复合物，胆酸，本胆烷酮醇[3～4]等。

（2）内源性热原:激素类：类固醇，前列腺素细胞因子：IL-6，IL-1β ，TNF-α 。

2 热原发热机理

目前关于热原致热的主要观点是：几乎所有的外源性发热物质均通过刺激免疫细胞分泌细胞因子而最终导致机体发热。首先是外源性热原进入机体后刺激免疫细胞产生内源性热原如IL-6、TNF、IL-1等细胞因子，这些因子通过终板血管器[5]直接或间接进入下丘脑视前区等中枢系统后，一方面升温介质和神经整合作用使体温上升，另一方面又通过内源性解热物质作用腹中膈（VSA）和中杏仁核（MAN）等体温负调节中枢限制体温升高[6]。

3 目前检测热原的方法

3.1 家兔检测法

家兔法检测热原的基本操作为：将药品静脉注射入家兔体内后，测其体温升高幅度，以此来判断热原的有无[7]。家兔法检测热原能很好地反映各种热原致热程度，但不能定量反映热原含量，不易标准化，并且存在种属差异[8]，个体差异[9]较大，造成结果重复性差等。

3.2 细菌内毒素法（BET）

1956年Bang[10]发现细菌悬液与鲎血细胞溶解产物会产生凝聚，1968年，Liven和Bang[11]以此为原理，建立起鲎试验法，即细菌内毒素法。细菌内毒素法检测热原的基本原理为：利用细菌内毒素可与鲎试剂特异性反应，可限量和定量检测内毒素含量[7]。细菌内毒素检测热原法灵敏度高，允许半定量或全定量检测细菌内毒素，但只能特异性地检测细菌内毒素，并且用BET 方法检查通过, 但却引起了临床热原反应[12]，表明细菌内毒素并非唯一的致热物质。并且鲎作为一种远古生物，因其不合理利用濒临灭绝。

3.3 体外热原检测法

新的热原实验方法为Duff和Akins（1982）[13]和Dinarello（1984年）[14]提出，他们利用人外周血单核细胞产生的细胞因子进行检测。至今多种检测系统不断被提出。

现在出现的新方法按细胞来源不同可分为三类：白细胞系法，人外周血单个核细胞法(PBMC法)[15～16]、人全血法[17～18]。国外对新方法的研究始于20世纪80年代，经过相关学者近30年的研究，目前已有7种方法（新鲜人全血IL-1β 、新鲜人全血-IL-6、PBMC-IL-6、MM6-IL-6、THP1-新喋呤、THP1-TNF-α 、冻存人全血-IL-1 ）分别于2004、2005年获得欧洲权威机构（包括欧洲替代方法论证中心，英国国家生物制品检定所）的正式论证。

体外热原检测新方法的优缺点：①可以很好的反映人体对热原的反应；②相关性好，重复性好；③检测方法相对家兔法简便，不需要使用动物；④操作均需在无菌条件下完成，对实验室要求高；⑤基本为人血或动物血液，对血液来源安全性存在疑问。

4 PBMC法检测热原

4.1 PBMC发展概况

PBMC法是细胞法中发展得较为成熟的方法，目前已被欧洲药典收载[19]。人外周血单个核细胞(简写为PBMC)不是单一细胞，它包含了人外周血中的各种免疫细胞，约12%为单核细胞，88%为淋巴细胞[20]。人血中能分泌免疫细胞因子的各主要细胞都包含其中。

人体对热原的反应是多种免疫细胞参与作用的结果，只用一种细胞并不能完全真实地模拟机体对热原的反应，而PBMC则克服了这个不足之处，因此该方法在可靠性上要优于其他单核／巨噬细胞法。Stephen Poole[16]，Anthony F.Suffredini[21]对该方法进行了比较详细的研究，发现其细胞因子分泌状况与人体发热的真实体内细胞因子分泌状况基本一致，该方法对细菌内毒素的检测限可达0.015 EU﹒mL-1。2005年召开的新热原检测方法国际论证会议上，对PBMC法的主要论证结果如下：该方法在3个实验室内的重复性分别为94.4% ，100% ，94.4% ；在3个实验室的再现性分别为80.6% ，86.1% ，88.9% ；方法能够识别热原阳性和阴性产品的准确性分别为92.2% ，95% ，而家兔法只有57.7% ，88.3%[22]。

4.2 PBMC体外检测热原机理

利用从健康人体全血分离得到的人外周血单个核细胞（PBMC）模拟人体，将其与热原标准品（如细菌内毒素）、受试药品分别孵育，通过比较其所致内源性热原（主要为细胞因子，如IL-6、IL-1、TNF-α）分泌量的多少，反映药品的致热活性。

4.3 PBMC分离、培养

健康志愿者外周血与等量磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 混合稀释后，缓慢加至淋巴细胞分离液的上方，密度梯度离心20min（2500 r﹒min-1）。小心收集位于分离液和血浆之间的单个核细胞层，并用PBS清洗2遍[23]，系统采用96孔组织培养板进行孵育，每孔加入RPMI-1640培养基100 uL、样品或空白对照品50 uL，37 ℃，5% CO2，95%湿度条件下孵育16～24 h，吸取上清液用ELISA方法检测细胞因子的含量[22]。

4.4 细胞因子（IL-6）检测

单核细胞激活检查法以人全血或外周血单个核细胞（PBMC)或单核细胞系作为检测用细胞。一般有三种方法，包括定量测定法、半定量测定法和参考批次比较测定法。定量测定法通过标准内毒素制定标准曲线，然后从标准曲线中读出热原的值；半定量测定法通过与标准内毒素溶液比较得出热原的浓度；参考批次比较测定法是供试品和经过验证的该制品的参考批次相比较来检测的一种方法。

目前选用的检测指标还没有完全趋于统一[24]。查阅文献[25～26]表明IL-6可作为一个很好的检测指标。并且美国食品药品监督管理局以同意将PBMC/IL-6检测法作为产品终热原检测的一个方法[25]。同时单核、巨噬细胞是重要的免疫感应和效应细胞, 单核巨噬细胞受抗原、有丝分裂原或活化因子作用后, 能转变为活化的单核、巨噬细胞。单核、巨噬细胞的免疫功能一方面直接吞噬破坏靶细胞和靶抗原, 另一方面又能分泌多种细胞因子, 并通过细胞因子继续产生免疫效应[27～28]PBMC包含了人血中能分泌免疫细胞因子的各主要细胞。因此可以用ELISA法检测使用PBMC细胞培养的样品或空白对照品。

5 结论

热原检测是严格控制各类非肠道用医药制品的质量，保障人民用药安全，促进医药事业发展的重要手段。从最开始的家兔检测法到研究最为深入的细菌内毒素法，本文从分析目前传统主要用于热原检测的方法的优缺点，到对体外热原检测新方法的提出再到本文主要综述的PBMC法。包括了PBMC的分离、培养、细胞因子的检测。

PBMC法可以很好检测热原，但依然存在某些问题急需解决：①试验中的试剂，血清等去除热原的问题；②实验室安全问题，使用的细胞株是否易受感染；③检测细胞因子的试剂盒及使用的标准品因生产厂家不同和同一厂家不同批号存在差异；④血液来源的安全性，个体对热原敏感性的差异。PBMC法作为体外热原检测方法之一，有很好重复性、再现性，检测普广，有很好的应用前景，同时满足3R[29]即减少(reduction)、替代(replace ) 和优化(refinement )实验动物的使用精神的体现。

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