生物鉴定法在中药鉴定中的应用及前景

吴伯英

生物鉴定法是近年来兴起的一种中药品质鉴定新方法，它和传统的基原鉴定法、性状鉴定法、显微鉴定法、理化鉴定法一起，并称为中药的五大鉴定法。生物鉴定法具有先进性、适用性、可操作性和专属性强等特征，并且能够突出中药的药效学作用，准确性高。

生物鉴定(bioassay)法又称“生物检定”或“生物测定法”。是利用中药或其所含的化合物对生物体(organism)的作用强度，以及用DNA特异性遗传标记特征和基因表达差异等来鉴别中药的品种和质量的一种方法。通常分为生物效应鉴定法和基因鉴定法两大类。生物效应鉴定法是利用药物对于生物(整体或离体组织)所起的作用，测定药物生物活性(biological activity)强度或药理作用，以鉴别中药真伪优劣的方法。该法以药理作用和分子生物学为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验方法和病理模型，通过被测物与相应的对照品在一定条件下比较其产生特定生物反应的剂量比例，测出药物的活性作用。常用的方法有免疫鉴定法、细胞生物学鉴定法、生物效价测定法、单纯指标测定法、DNA遗传标记鉴定法、mRNA差异显示鉴定法等[1]。

1 生物鉴定法

1.1 免疫鉴定法

免疫鉴定法是利用中药含有的特异蛋白为抗原制备的特异抗体，与供试品中特异抗原结合产生沉淀反应的一种方法，可准确地鉴别中药品种。不同的动植物药材含有不同的特异蛋白，免疫鉴别即用该蛋白制备的特异抗体与待检品中的特异抗原结合产生沉淀反应来鉴别药材的真伪[2]。该技术适用于动物药材的鉴别，尤其是亲缘关系比较接近的动物药间的鉴别[3]。国内学者采用免疫电泳法及琼脂免疫扩散法准确鉴定了虎、豹等多种动物的骨骼，还能将豹骨进一步鉴定为雪豹、石豹或金钱豹，说明免疫鉴定方法是一种特异性很强的鉴别法[4]。免疫鉴定法还可以采用酶标法和单克隆抗体法进一步深入研究[5]。有待成为动物类中药材鉴定中的主流技术。

1.2 细胞生物学鉴定法

细胞生物学鉴定法主要采用染色体的分类技术对中药进行鉴别。中药某个特定种群的生物体细胞中染色体的形态、组型是稳定不变的，代表该种群的基本遗传特征，根据该特征即可鉴定中药的品种，适用于果实和种子类中药的鉴定，将需鉴定的药材培养发芽后，取根尖制片，观察并找到较好的染色体排列，制成核型模式图。测定染色体长臂和短臂长度，计算同源染色体相对长度及臂长比值、着丝点指数、差值，求出核型公式，根据“不对称核型分类”标准确定其核型，与已知该植物染色体的背景资料比较，即可确定药材种属。该方法已被用于中药栀子等的鉴别[6]。

1.3 生物效价测定法

生物效价测定(estimation of biological potency)法就是测定药物对生物机体某方面作用的强度。如黄柏、黄连、黄芩等具清热功效中药的抑菌率或抗菌效价(titer)的测定，对洋地黄强心指标生物效价的测定等。生物效价测定法是利用生物体的反应来鉴定中药有效成分的含量或效价，测定药物的疗效和毒性(toxicity)的方法。有些中药，如洋地黄及其制剂，铃兰毒苷及其注射液，到目前为止还没有找到一种比较合适的化学分析方法来确定它们的有效成分含量或效价。所以，就宜用生物检定法进行效价测定。生物效价测定的主要原则是将供试品与对照品(包括中药、纯成分)在严格规定的条件下，比较它们对生物体所产生的反应强度，再计算出中药或其制剂的剂量标准。中药的效价通常以1g中药中所具有的“作用单位”数来表示。这种单位是指在一定条件下所表现一定生理作用的最小剂量。例如，2010年版《中国药典》规定洋地黄制剂的质量标准[7]：洋地黄叶(Folium Digitalis)要保证同样洋地黄制剂的各种商品的效价一致，而并不是为了使不同的精制强心苷效价相等。因为这种方法不能把它在肠内吸收的差别，作用的快慢以及效力的久暂等估计在内。鉴于现尚缺乏可靠的定量法，故可利用动物试验以检定药物的效力。此种生物检定法包括蛙法，猫法，豚鼠法及鸽法等。王盛民等[8]以穿心莲对照药材为标准品对穿心莲药材和含穿心莲的中成药进行生物检定，为其质控方法进行了生物检定法研究，方法可行。

1.4 纯指标测定法

单纯指标测定法就是测定某药物或某类药物某一特性或某一药理作用的强弱。如对含皂苷类中药溶血指数的测定，如使用溶血法鉴定柴胡和大叶柴胡[9]；对含苦味中药苦味指数的测定；对含蒽醌类大黄的泻下作用的测定；对青黛中靛玉红，两头尖中竹节香附素A的抗癌活性的测定；黄芪中黄芪皂苷甲，三七中三七皂苷降血压和扩张血管作用的测定；对人参中人参多糖，刺五加根中刺五加多糖和红花多糖的免疫作用的测定；对三七抗凝血作用的测定等。

1.5 DNA遗传标记鉴定法

DNA分子是由G、A、C、T 4种碱基(base pairs)构成，为双螺旋结构的长链分子，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列序列中，遗传上的差异便表现在4种碱基排列顺序的变化之中，这就是生物的遗传多样性。比较物种间DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是DNA分子遗传标记鉴别。在DNA分子上，有编码与物种密切相关的基因区域，不十分密切相关的基因区域和非编码基因区域。DNA遗传标记：这些基因区域在生物进化过程中所受的压力不同，前者所受选择压力大，表现出高度的保守性；后者所受选择压力小，表现出较大的差异性。正是这种压力的不同，使得DNA分子的不同区域有不同程度的遗传多样性。因此可以选择适当的DNA分子遗传标记，在科，属，种，亚种，居群和个体上对研究对象进行鉴别。

DNA遗传标记鉴定中药的主要方法：DNA序列测定法，随机扩增多态性DNA指纹分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)，任意引物PCR反应技术(arbitrarily primed PCR，AP-PCR)，限制性内切酶酶切片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，PCR扩增特定片断的限制性位点分析等方法[10～11]。黄丰等[12]对西红花及其5种伪品进行鉴定，并证明 RAPD对于应用在干燥的植物类生药的鉴定上有实际应用价值。张西玲等[13]利用特异性引物对当归、大黄种子中rRNA基因内转录间隔区进行套式 PCR扩增，并将其碱基序列测定，结果显示当归、大黄种子 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列具有明显的差异和可对比性 ，不同植物中药材种子 rRNA基因内转录间隔区碱基序列可作为从分子水平进行鉴定的标记。刘中权等[14]采用根据22种亚洲产龟类的线粒12SrRNA基因片段序列，设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物龟的鉴别引物，用该对引物扩增从乌龟和其他 18种龟48个样品的 DNA模板。结果：在 72℃的复性温度下进PCR，4个乌龟的模板 DNA均得到约180bp的阳性扩增而其他各龟的模板DNA，在同样条件下无扩增产物。用对鉴别引物经1次 PCR反应便可准确地鉴定受试原动是否为乌龟。Fushimi等[15]采用PCR2RFLP方法对人参属3种植物人参、西洋参和竹节参进行了核基因组18S-rRNA片段分析，结果发现Ban和Dde I酶解的指纹图谱较易将其区别开来。

1.6 mRNA差异显示鉴定法

mRNA差异显示鉴定法是利用中药不同组织或细胞在基因表达(gene expression)上的差异进行鉴定的一种方法。它通过将总RNA反转录成单链cDNA(complementary DNA)，然后进行PCR扩增反应，分离出不同分子大小的DNA，挑选出有差异的表达基因进行序列分析。既可以制备探针用于稳定灵敏的检测实验，也可以制备其蛋白产物及其抗体进行免疫检测。采用该技术，可以提炼出栽培和野生，道地和普通药材等之间的特征，可望广泛用于中药的品种和质量鉴定[10～16]。

2 讨论

中药生物鉴定法侧重中药的品质和临床用药的安全性、有效性等的有机结合的研究，可以配合其他鉴定方法综合解决中药品质鉴定的难题，并尝试为中医与中药现代化的结合找到突破口。

中药的品种鉴定和质量控制是中医药研究的基础，选择最佳的方法、手段鉴定和评价中药是新药开发的重要环节。生物鉴定法目前在中药鉴定领域已有很大的应用，但目前此方法尚处于起步阶段，在具体实施中相关方法和技术还有待于进一步完善。但我们相信这种方法在不久的将来一定会成为鉴定和评价中药的重要手段。

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