马来酸桂哌齐特对脑缺血后炎症反应、轴突蛋白的表达及神经功能的影响

黄艳玲，张 敏，贺 曦

（重庆市急救医疗中心神经内科 400014）

白细胞介素（interleukin，IL）是主要由单个核细胞（包括淋巴细胞和单核－巨噬细胞）产生的一组免疫活性因子，作用于淋巴细胞、巨噬细胞和其他细胞，共同参与机体免疫反应、应激反应及炎症的调节。研究发现，IL在脑缺血后表达明显增加，产生神经毒性，介导脑缺血后炎性反应，参与缺血性脑损伤。本研究拟观察马来酸桂哌齐特（cinepazide maleate，CM）对大鼠脑缺血／再灌注后脑组织炎症反应、神经丝蛋白－200（NF－200）的表达及对神经功能的影响，更深入地探讨CM对缺血性脑损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 成年雄性SD大鼠48只，由重庆医科大学实验动物中心提供，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，体质量250～280g。造模前适应性喂养1周。随机分为正常组、假手术组、缺血／再灌注2d组、缺血／再灌注7d组、CM治疗2d组和CM治疗7d组，每组8只。

1.1.2 实验药品与用法 CM由北京四环生物制药有限公司生产，规格为每支80mg。于再灌注后按3.0mg／kg进行稀释，立即从尾静脉注射，每日1次。

1.2 方法

1.2.1 大脑中动脉闭塞 （MCAO）模型的制作 术前12h禁食。参照 Longa等［1］及 Nagasawa和 Kogure［2］的线栓法:用3.5%水合氯醛（1mL／100g，腹腔注射）麻醉大鼠。将麻醉后的大鼠仰卧位固定，备皮，术区消毒，铺无菌洞巾，颈正中切口，暴露并分离右侧颈总、颈外与颈内动脉，电凝颈外动脉的分支，结扎并离断。将颈内动脉与颈外动脉之间的交通支凝断，夹闭颈总动脉及颈内动脉，于颈外动脉残端切口向颈内动脉插入栓线（18.0±0.5）mm，感觉有阻力即达大脑中动脉起始部，固定栓线，缝合伤口。缺血2h后拔出栓线，实现再灌注。大鼠缺血／再灌注6h后的神经功能评分采用Longa评分法［1］:0分为无神经功能缺失症状；1分为轻度局灶性神经功能缺失症状（不能完全伸展左侧前肢）；2分为中度局灶性神经功能缺失症状（向左侧转圈）；3分为中、重度局灶性神经功能缺失症状（向左侧倾倒）；4分为不能自发行走，意识水平降低。1～3分入组，0分和4分者均被剔除。到达时间点后，取材时发现蛛网膜下腔出血者也剔除，随机补充。

1.2.2 脑组织IL－1β，IL－6含量测定 各组大鼠在脑缺血／再灌注2d，7d后断头取脑，于冰盘上迅速取缺血侧大脑半球，用全蛋白提取试剂盒提取蛋白（南京凯基），低温离心后留取上清液，采用ELISA测定IL－1β及IL－6，试剂购自R＆D公司，以上2个指标均按试剂盒说明操作。

1.2.3 脑组织NF－200免疫组织化学染色 将大鼠深度麻醉后开胸，用生理盐水与4%多聚甲醛各150mL进行灌流，断头取脑，4%多聚甲醛液中固定4～6h，然后放入70%乙醇中送组织切片，片厚8μm。取相同层面切片分别做 HE染色和免疫组织化学染色。免疫组化采用S－P法，DAB显色。所用抗NF－200的一抗浓度均为1∶100，购自博士德公司；S－P即用型工作试剂盒由北京中杉生物公司提供，免疫组化步骤按照试剂盒说明书操作。NF－200阳性蛋白的平均光密度值用Imagepro－Plus 6.0软件进行测定，具体操作参考软件教程。

2 结 果

2.1 神经功能评分 根据Longa等［1］评分法，术后6h缺血／再灌注组和CM治疗组大鼠评分（共32只）达到3分的共7只（7／32，21.9%），2分的共19只（19／32，59.4%），1分的共6只（6／32，18.7%）。在缺血／再灌注后第7天，两组大鼠的评分较前明显改善（P＜0.05）；此外，CM治疗组大鼠的神经功能改善程度较缺血／再灌注组更明显（P＜0.01）。见表1。

表1 两组大鼠缺血／再灌注后第2、7天神经功能评分（，分）

表1 两组大鼠缺血／再灌注后第2、7天神经功能评分（，分）

正常组、假手术组评分为0；a:P＜0.05，与缺血／再灌注第2天比较；b:P＜0.01，与缺血／再灌注组比较。

组别 第2天 （n＝16） 第7天（n＝16）缺血／再灌注组 2.00±0.76 1.25±0.71a CM治疗组 2.00±0.76 0.50±0.53ab

2.2 脑组织IL－1β，IL－6的含量 正常组和假手术组脑组织IL－1β、IL－6水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），缺血／再灌注后第2天，缺血／再灌注组与CM治疗组脑组织IL－1β、IL－6水平均较正常组明显升高（P＜0.01），但治疗组明显低于缺血／再灌注组（P＜0.01）。随后IL－1β、IL－6逐渐下降，第7天时缺血／再灌注组和CM治疗组IL－1β，IL－6水平较前明显下降（P＜0.01），且CM治疗组较缺血／再灌注组下降更明显（P＜0.01），其中IL－6的水平与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 脑组织NF－200 免疫组化检测显示正常组和假手术组大鼠皮质内神经元轴突形态规则，NF－200阳性纤维较长，排布均匀。缺血／再灌注2d组大鼠缺血侧皮质神经元NF－200阳性纤维缩短且数量显著减少（P＜0.01），排布紊乱；7d后阳性轴突数目有所增加，但仍低于正常水平（P＜0.01）。与相同时间点缺血／再灌注组相比，CM治疗组轴突形态较规则，NF－200阳性纤维表达有所增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表2 各组大鼠脑组织IL－1β，IL－6含量的比较（，pg／mL）

表2 各组大鼠脑组织IL－1β，IL－6含量的比较（，pg／mL）

a:P＜0.01，与正常组比较；b:P＜0.01，与缺血／再灌注第2天比较；c:P＜0.01，与缺血／再灌注第7天比较。

指标 正常组 假手术组缺血／再灌注组第2天 第7天CM 治疗组第2天 第7天IL－1β 426.00±35.43 430.38±36.36 873.50±68.41a616.75±37.46ab 649.50±29.95ab 489.25±43.89abc IL－6 585.38±82.52 592.25±38.17 936.88±99.57a776.88±52.77ab 808.38±67.33ab 639.50±52.52bc

表3 各组大鼠缺血／再灌注后第2、7天缺血侧皮质NF－200的平均光密度值（）

表3 各组大鼠缺血／再灌注后第2、7天缺血侧皮质NF－200的平均光密度值（）

a:P＜0.01，与正常组及假手术组比较；b:P＜0.01，与缺血／再灌注第2天比较；c:P＜0.01，与缺血／再灌注第7天比较。

组别平均光密度值第2天 第7天正常组0.333±0.064 0.333±0.064假手术组 0.315±0.117 0.317±0.118ab缺血／再灌注组 0.118±0.084a 0.207±0.037ab CM治疗组 0.186±0.029ab 0.289±0.143bc

3 讨 论

炎性反应是缺血性卒中的一个重要病理过程，缺血状态下高浓度的炎性细胞因子可能参与了神经损伤。近期研究发现，IL－1等可激活局部血管内皮细胞和白细胞，诱导细胞大量牢固的黏附，导致微血管阻塞，从而加重脑细胞的损伤［3］。IL－6也是中枢神经系统缺血相关的重要炎症反应分子之一，IL－1 mRNA和IL－6mRNA在中枢神经系统海马结构和齿状回均有定位［4］，IL－6水平在脑缺血／再灌注早期升高，认为可能与中性粒细胞和巨噬细胞的浸润有关。在本实验中，通过对大鼠缺血／再灌注第2天的脑组织匀浆进行ELISA检测，作者发现IL－1β和IL－6均较正常时明显增加，提示IL在脑缺血早期即参与了脑损伤的病理、生理过程。之后，在第7天，IL－1β和IL－6水平均有所回落，表明了自身调节启动了内源性修复。

长久以来，中枢神经系统损伤后必然导致某些功能永久丧失的悲观理念一直在生物医学界占统治地位。然而，中枢神经系统损伤后丧失的功能是可以得到一定程度恢复的［5－6］。脑内神经元胞体只占据皮质总体积的3%，而轴突、树突及神经胶质则占了97%，当部分神经元死亡时，存活细胞中丰富的轴突可通过侧枝出芽的方式取代损伤的轴突，代偿其功能［7－8］。NF是构成神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主要成分，在维护神经元的功能和轴浆转运等一系列与脊髓损伤修复相关的病理、生理变化中发挥着重要作用［9］。NF依据相对分子质量的不同可分为 NF－68、NF－140及 NF－200三种。其中 NF－200在正常情况下只存在于轴索中，而胞体不含或很少含有，故正常时NF－200胞体为阴性。有研究发现，在脊髓损伤区附近的神经元在创伤刺激及多种诱导因子的作用下，能大量合成及积存NF－200以适应神经再生的需要，此时NF－200可在神经元胞体内着色［10－11］。脊髓不完全损伤后 NF－200阳性神经元的数量及神经元胞体着色的程度与后肢的功能恢复情况有密切的关系，说明NF－200染色不仅能显示伤后神经元的形态，也能反映其功能状态［12］。在缺血／再灌注后，NF－200在皮质的表达明显减少，这与神经元缺血／再灌注损伤的发生是一致的。轴突的损伤及缺失，必然对神经细胞间的功能联系和传递有着不可避免的影响，因此大鼠的神经功能受损后恢复存在困难。这也与本实验结果是一致的。

CM作为新一代的哌嗪类钙离子拮抗剂，除了能够抑制钙离子内流、扩张血管外，研究还发现它能通过抑制腺苷脱氨酶的作用延迟腺苷的降解，减少肌酐和次黄嘌呤的生成，使腺苷在组织内蓄积。腺苷作为内源性保护因子在脑缺血损伤中表现出了显著的自稳态调节及神经调节作用［13］。本研究运用CM对脑缺血／再灌注大鼠进行急性期治疗，从减轻脑组织炎症反应、促进轴突再生及改善神经功能3个方面，探讨了CM对急性缺血性脑损伤的保护作用。CM治疗组与缺血／再灌注组比较后发现:CM 能够显著抑制脑内IL－1β、IL－6的过度表达，明显增加脑皮质NF－200的表达，还伴随神经功能缺损的明显改善。这些都提示，CM可能从以上环节对缺血性脑损伤发挥了较好的保护作用，且这种保护作用随着用药时间的延长更加突出。

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