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葡萄糖酸锌对心肌缺血/再灌注损伤保护作用的动物实验研究*

2012-08-13孙品兰罗明军张乐星谭祥惠

重庆医学 2012年5期
关键词:黄嘌呤心肌剂量

刘 丹,孙品兰,罗明军,黄 春,张乐星,谭祥惠

(重庆三峡医药高等专科学校,重庆 万州 404120)

心肌缺血/再灌注损伤既是不可预知的(如心肌梗死),也是不可避免的(如冠状动脉搭桥术、冠状动脉溶栓术、冠状动脉再通术等),所以探索其发生机制及防治药物越来越重要。有研究表明,锌可抑制·OH生成,对心脏、肝脏和脑等多种器官的缺血/再灌注损伤(IR)有保护作用。但关于葡萄糖酸锌(zinc gluconate,ZG)是否可以通过抑制·OH生成,减轻脂质过氧化反应,改善心肌能量代谢,进而减轻钙超载;减少细胞因子IL-1β的释放,抑制炎症反应,保护缺血/再灌注损伤心肌,报道较少。所以本实验拟研究ZG对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠(重庆市中药研究院实验动物中心提供)50只,雄性,体质量250~280g。主要试剂:ZG(天津市光复精细化工研究所);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙 二 醛 (malondraldehyde,MDA)、Na+-K+-ATP 酶(Na+-K+-ATPase)试剂盒(南京建成生物工程研究所);大鼠IL-1βELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血/再灌注损伤实验模型的建立及其分组

1.2.1.1 分组 按随机化原则分为5组(每组10只):(1)ZG 3个剂量组,即 167[1/15 半 数致死剂量 (LD50)]、250(1/10 LD50)、357(1/7LD50)mg/kg剂量组,分别以相应剂量ZG(溶于蒸馏水中,2mL)灌胃,每次2mL,上、下午各1次,依据ZG的半衰期(t1/2):t1/2(h)=2.46±0.30[1],两次灌胃给药间隔时间为2.5h。于末次灌胃1h后行冠状动脉左前降支结扎30 min,再灌注60min。(2)模型组,给予ZG各剂量组等容量的生理盐水4mL灌胃,其他处理同上。(3)假手术组,只穿线不结扎,其他处理同上。

1.2.1.2 模型制作 大鼠心肌缺血/再灌注损伤实验模型[2]:取雄性SD大鼠,以乌拉坦(1g/kg)腹腔注射。描记肢体Ⅱ导联心电图。气管插管,自左侧第1~3肋开胸,采用人工呼吸机正压呼吸。暴露大鼠心脏后,拉紧结扎线,使硅胶管压迫冠状动脉左前降支而致闭塞30min,而后切断结扎线再灌注60 min。冠状动脉断流及再通成功与否以心电图肢体导联的ST段抬高及恢复作为标准。

1.2.2 检测指标

1.2.2.1 大鼠心肌组织中IL-1β含量的测定 于实验结束后立即取左室游离心肌组织0.1g,用4℃冰生理盐水将血液洗净,按组织与生理盐水1∶9的比例制备组织匀浆。离心(3000r/min,15min),取上清液备用。用ELISA法测定心肌组织中IL-1β的含量。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。操作步骤按武汉博士德生物工程有限公司试剂盒说明书进行。

1.2.2.2 大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase和SOD活性、MDA和Ca2+含量的测定 于实验结束后立即取左室游离心肌组织0.4g,制备组织匀浆,取上清液备用。Na+-K+-ATPase用比色法测定,SOD用羟胺法测定,MDA用硫代巴比妥酸法测定,蛋白含量用考马斯亮蓝法测定,操作步骤按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。Ca2+用离子电极直接测定法,在自动生化分析仪上测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS12.0软件进行统计学处理。所有数据以表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ZG对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase活性、IL-1β和Ca2+含量的影响 与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织中 Na+-K+-ATPase活性降低,IL-1β和Ca2+含量升高(P<0.01),与模型组相比,ZG 3个不同剂量组大鼠心肌组织中 Na+-K+-ATPase活性升高(P<0.01),IL-1β和Ca2+含量降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase活性、IL-1β和Ca2+含量的变化()

a:P<0.01,与假手术组相比;c:P<0.05,b:P<0.01,与模型组比较。

组别 Na+-K+-ATPase(U/mgprot)IL-1β(pg/mL)Ca2+(mg/L)假手术组1.93±0.32 2345.25±55.775.89±0.85模型组 1.08±0.22a 3522.96±145.63a9.63±1.43a ZG组(ng/kg)167 1.56±0.21b 3020.38±128.35b 7.49±1.47c 250 1.69±0.21b 2832.40±78.69b 6.94±1.25b 357 1.85±0.33b 2642.10±107.70b 6.27±1.14b

表2 各组大鼠心肌组织中SOD活性和MDA含量的变化()

表2 各组大鼠心肌组织中SOD活性和MDA含量的变化()

a:P<0.01,与假手术组比较;c:P<0.05,b:P<0.01,与模型组比较。

组别 SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)假手术组118.54±30.34 2.41±0.33模型组 67.16±17.01a 5.72±0.73a ZG组(mg/kg)167 80.86±16.01c 3.34±0.41b 250 90.95±24.95b 2.89±0.29b 357 101.11±13.56b 2.58±0.37b

2.2 ZG对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织中SOD活性和MDA含量的影响 与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织中SOD活性降低和MDA含量升高(P<0.01),与模型组相比ZG 3个不同剂量组大鼠心肌组织中SOD活性升高(P<0.05)和MDA含量降低(P<0.01)。见表2。

3 讨 论

心肌缺血/再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,主要原因是在再灌注过程中产生了大量的氧自由基(OFR)、Ca2+超载、中性粒细胞浸润引起炎症反应,能量代谢障碍、内皮细胞自稳态失衡[3-5]。它们之间互为因果、互相影响。其中,OFR和Ca2+超载成为细胞致死的主要原因[6]。

心肌缺血/再灌注时,因高能磷酸化合物减少而使Na+-K+-ATPase活性降低,结果导致大量Na+经L型Ca2+通道进入细胞内,细胞内Na+增高,进而激活Na+-Ca2+交换机制,使细胞内Ca2+增高。同时因能量不足,使肌膜及肌浆网(SR)的Ca+-ATPase活性降低,不能将肌浆中过多的Ca2+泵出或摄入肌浆网,细胞外Ca2+内流,最终导致Ca2+超载[7-8]。Ca2+与细胞质受体钙调蛋白结合后,可激活蛋白酶,使黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶(XO),缺血时,产生黄嘌呤。当再灌注后,黄嘌呤在XO的作用下生成超氧阴离子自由基)及过氧化氢(H2O2),除直接损伤细胞外,还可通过Haber-Weiss反应转变成·OH,然后经瀑布反应生成其他自由基[9]。在OFR中主要是·OH引起心肌损伤,导致膜脂质过氧化,再经过氧化物酶分解生成 M DA,最终造成肌纤维过度收缩,三磷酸腺苷耗竭,线粒体超微结构损害,使依赖能量的离子泵活性降低,进而促进钙超载。

IL-1β在心肌缺血/再灌注时表达水平增高。已有研究证实,细胞因子IL-1β和黏附分子(ICAM-1)在心脏移植后缺血/再灌注损伤的病理过程中起着重要作用[10]。其引起心肌损伤的机制可能有:IL-1可直接上调ICAM-1和内皮白细胞黏附分子-1(ELAM-1)表达,而ICAM-1、ELAM-1诱导中性粒细胞(PMN)黏附在内皮细胞和内皮下基质并穿过内皮迁移流入缺血区,通过阻塞微血管、释放OFR等机制导致心肌细胞损伤,使梗死过程加剧[11]。同时Ca2+也能激活PMN引起呼吸爆发,可产生大量的OFR,损伤细胞。

心肌缺血/再灌注时,锌对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系所引发的OFR有抑制作用,它能减少铁离子进入细胞并抵制其在羟自由基引发的链式反应中的催化作用[12],有实验证实,外源给锌可以明显减轻肝脏缺血/再灌注损伤,抗脂质过氧化和抑制ICAM-1/VCAM-1表达是其作用的重要机制[13]。心肌缺血/再灌注损伤时,补锌组血清和心肌组织中MDA含量降低、SOD 活性升高[14]。

本实验结果显示,与模型组相比,ZG 3个不同剂量组大鼠心肌组织中SOD活性升高和MDA含量降低。有研究表明,在缺血/再灌注时,及时补充能量,可减少OFR的生成及减轻Ca2+超载,促进心肌功能恢复。与模型组相比,Na+-K+-AT Pase活性升高,Ca2+和IL-1β含量降低。提示ZG对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用,其作用与抑制·OH生成,减轻脂质过氧化反应,同时葡萄糖增加血液循环中糖酵解底物浓度,促进心肌功能恢复,升高Na+-K+-ATPase活性,进而减轻Ca2+超载;减少IL-1β释放,抑制炎症反应。本实验结果可为临床应用锌制剂治疗心肌缺血/再灌注损伤提供一定的理论基础。

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