海刺猬体腔液凝集素的纯化、性质及其色氨酸的化学修饰

李丹彤吴振海李悦王树敏朱莹

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

海刺猬体腔液凝集素的纯化、性质及其色氨酸的化学修饰

李丹彤,吴振海,李悦,王树敏,朱莹

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

通过DEAE-纤维素52离子交换层析、Sephadex G-200凝胶层析,从海刺猬体腔液中分离纯化海刺猬Glyptocidariscrenularis凝集素 (简称为GCL),并对其部分性质和色氨酸的化学修饰进行了研究。结果表明:在还原与非还原SDS-PAGE上,GCL都显示单一蛋白质条带,其相对分子量为94 462;GCL对人O型、兔、鸡、狗红细胞均具有血凝活性,对兔和狗红细胞的血凝活性最强,但对人A、B、AB型及鲫红细胞无血凝活性;GCL血凝活性在温度为4～33℃时最高,经36℃热处理10 min后,GCL对兔红细胞的血凝活性保留25%,经48℃加热10min后,其血凝活性完全丧失;GCL血凝活性在pH为7.5～8.5时最高; Ca2+对GCL血凝活性无抑制作用,EDTA和Mg2+对其血凝活性有抑制作用;GCL血凝活性不被所测试的α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和γ-球蛋白所抑制,但被蔗糖和麦芽糖所抑制,最小抑制浓度分别为40 mmol/L和20 mmol/L;用N-溴代丁二酰亚胺 (NBS)对GCL分子中的色氨酸 (Trp)残基进行化学修饰,有5.1个Trp残基被修饰,修饰后其血凝活性丧失75%,表明Trp残基是GCL血凝活性的重要组成部分。

海刺猬;凝集素;纯化;化学修饰

凝集素是一类具有糖专一性、可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白。凝集素具有凝集细胞,抑制肿瘤细胞增殖,激活淋巴细胞,抑制血小板凝集,抗菌、抗病毒等多种生物活性。化学修饰是研究凝集素结构与功能关系的基础,目前已有对川木通[1]、大黑花芸豆[2]、黄精[3]等凝集素分子进行化学修饰的研究[1-3],以探讨凝集素的作用机理。

海刺猬Glyptocidariscrenularis属于无脊椎动物棘皮动物门、海胆纲、正形目、疣海胆科,是疣海胆科现今仅存的唯一代表种。目前,国内外已有一些关于海胆凝集素的研究报道。Giga等[4]、Nakagawa等[5-6]进行了紫海胆Anthocidariscrassispinat体腔液及Toxopneustidpileolus球形叉棘凝集素的分离纯化及其性质的研究;Ozeki等[7]进行了紫海胆卵凝集素氨基酸序列及其性质的研究;Shamshurina等[8]在光棘球海胆Strongylocentrotusnudus的体腔液中,发现了2种免疫化学相同的甘露糖结合凝集素;Takei等[9]从Toxopneustidpileolus球形叉棘中,分离得到一种海胆凝集素 (sea urchin lectin-1, SUL-1),发现SUL-1可以诱导DC分化成熟和Th1细胞极化,并可应用于癌症免疫治疗的DC疫苗中。目前,关于海刺猬凝集素的研究国内外尚未见报道。本研究中,作者从海刺猬体腔液中分离纯化海刺猬凝集素 (简称为GCL),并对其部分性质和色氨酸的化学修饰进行研究,旨在为研究海刺猬凝集素的作用机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

海刺猬购于大连市荣盛水产品批发市场,兔子购于大连医科大学辽宁省实验动物中心,鸡、鲫由市场购买,狗血由某宠物医院提供,人全血由大连市红十字血液中心提供。

试验试剂有:Sephadex-G 200(Phannacia进口分装)、蓝色葡聚糖 (Blue Dextran 2000)(上海泊奥生物科技有限公司)、细胞色素C(相对分子量为11 700)(Sigma)、木瓜蛋白酶 (相对分子量为21 000)(上海佳和生物科技有限公司)、牛血清白蛋白 (相对分子量为66 200)(上海浦江生物化学研究所)、γ-球蛋白 (相对分子量为165 000) (human,Serva)、DEAE-纤维素52(Whatman进口分装)、N-溴代丁二酰亚胺 (NBS)(国药集团化学试剂有限公司),其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。

1.2 方法

1.2.1 凝集素的分离纯化

1)粗提液的制备 海刺猬购回后用过滤海水冲洗干净,再用注射器从其缘口膜抽取体腔液,经离心 (6 000 r/min,4℃,30 min),去除沉淀,取上清液,在TB(0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.5)缓冲液中透析48 h(4℃),中间更换两次透析液,即得凝集素粗提液。

取上清液,在 TBS(0.15 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.5)缓冲液中反透析48 h (4℃),中间更换两次透析液,测定其血凝活性。

2)DEAE-纤维素52离子交换层析

第1次离子交换层析。先用TB缓冲液平衡层析柱至A280nm＜0.01,再将凝集素粗提液上层析柱(1.6 cm×30 cm)进行分步洗脱,即先用洗脱液Ⅰ(含0.2 mol/L NaCl的TB缓冲液)进行洗脱,从第14管开始再用洗脱液Ⅱ (含0.5 mol/L NaCl的TB缓冲液)进行洗脱,流速为30 mL/h,每管5 mL,在280 nm下测定吸光值 (A280nm)。用蒸馏水对各蛋白质吸收峰进行充分透析,然后在TBS缓冲液中反透析,用兔红细胞测定其血凝活性,收集有血凝活性的组分。

第2次离子交换层析。样品为第1次离子交换层析后收集到的具有血凝活性的组分。将洗脱液Ⅰ(含0.2 mol/L NaCl的TB缓冲液)装入梯度混合器的混合瓶中,再将洗脱液Ⅱ (含0.5 mol/L NaCl的TB缓冲液)装入储藏瓶中,开始进行梯度洗脱。其余方法与步骤同第1次离子交换层析,测定A280nm,收集具有血凝活性的组分。

3)Sephadex G-200凝胶层析[10]将Sephadex G-200处理后装层析柱 (1.6 cm×90 cm),样品为第2次离子交换层析后收集到的具有血凝活性的组分,层析用洗脱液为含0.2 g/L叠氮化钠 (NaN3)和9 g/L NaCl的 PBS(0.015 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4,pH 7.2)缓冲液,流速为18 mL/h,每管3 mL。用兔红细胞检测其血凝活性,并测定A280nm。收集具有血凝活性的组分,经透析、冷冻干燥,得到GCL纯化样品。

1.2.2 凝集素的性质

1)蛋白质含量的测定[11]采用紫外分光度法测定蛋白含量,以牛血清白蛋白作为对照。

2)血凝活性的测定[12]在96孔V型血凝板上,用40μL GCL与等量生理盐水系列倍比稀释后,加入体积分数为2%的红细胞悬浮液40μL,振匀,静置2 h,肉眼观察,无凝集现象时红细胞呈大红点状并沉积在V型孔底部,有凝集现象时红细胞呈网状不下沉,血凝活力以产生凝集现象时的最小凝集素量或凝集素最大稀释倍数的对数值(log2) 表示。

3)分子量的测定[13]采用SDS-PAGE电泳方法测定分子量。浓缩胶浓度为50 g/L,分离胶浓度为150 g/L,以细胞色素C、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白和γ-球蛋白作为标准蛋白。

4)热稳定性的测定 将凝集素粗提液分成若干份,每份取0.2 mL,分别在4～60℃的温度梯度下温育,每一温度下分别保温5 min和10 min后取样,冷却,测定其血凝活性。

5)pH对GCL血凝活性的影响 参照Ahmed等[14]的方法,配制pH为4.0～10.5的系列缓冲液,测定不同pH缓冲液条件下GCL的血凝活性。pH为4.0～6.0时,采用0.015 mol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液;pH为6.5～7.5时,采用0.015 mol/L磷酸盐缓冲液;pH为8.0～9.0时,采用0.015 mol/L Tris-HCl缓冲液;pH为9.5～10.5时,采用0.015 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液。在96孔V型血凝板上,先在每孔加入40μL pH缓冲液,再往第一孔中加入40μL GCL溶液,混匀后进行倍比稀释,然后加入40μL体积分数为2%的兔红细胞悬浮液,振匀,静置2 h,观察不同pH缓冲溶液对GCL血凝活性的影响。

6)EDTA及二价金属离子对GCL血凝活性的影响[15]在96孔V型血凝板中,分别加入40μL 100 mmol/L的EDTA、CaCl2、MgCl2溶液,用生理盐水进行倍比稀释,然后加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的GCL,静置15 min(室温)后,再加入40μL体积分数为2%的兔红细胞悬浮液,振匀,静置2 h,观察EDTA及二价金属离子对GCL血凝活性的影响。

7)血凝抑制的测试 选择糖类:α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、麦芽糖、D -葡萄糖,起始浓度为80 mmol/L,选择糖蛋白:γ -球蛋白,起始浓度为20 mg/mL。在96孔V型血凝板中,分别加入40μL各种糖、糖蛋白溶液,用生理盐水进行倍比稀释,然后加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的GCL,静置15 min(室温)后,再加入40μL体积分数为2%的兔红细胞悬浮液,振匀,静置2 h,测定每种糖和糖蛋白对GCL血凝活性的最小抑制浓度。

1.2.3 色氨酸的化学修饰 参照鲍锦库等[16]的方法,用pH为4.0的0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲液配制GCL溶液,使其浓度为2.56 mg/mL,然后每次加入10μL浓度为10 mmol/L的NBS溶液 (用pH为4.0的0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲液配制),间隔5 min测定A280nm,再加入 NBS溶液,直至A280nm不再下降 (或略有升高)为止,透析除去过量的NBS,收集样品浓缩并测定其活性。定量计算被修饰的色氨酸残基:

N(Trp)=(1.31×ΔA280nm×Mr×V)/(5500×m),

或

N(Trp)=(1.31×ΔA280nm×Mr)/(5500×ρ),其中:N(Trp)为每个GCL分子中被修饰的色氨酸 (Trp)残基数;Mr为GCL的分子量;V为反应体系的初始体积 (mL);m为GCL的含量 (mg);ρ为被滴定溶液中蛋白质的质量浓度 (mg/mL); 1.31为经验系数;5 500为色氨酸的摩尔消光系数。

2 结果与讨论

2.1 GCL的分离纯化

海刺猬体腔液经离心、透析得到凝集素粗提液;凝集素粗提液经第1次DEAE-纤维素52离子交换层析,得到2个蛋白峰和1个活力峰 (图1);经第2次DEAE-纤维素52离子交换层析,得到1个蛋白峰和1个活力峰 (图2);再经Sephadex G-200凝胶层析,得到2个蛋白峰和1个活力峰 (图3),收集具有血凝活性的组分,经透析、冷冻干燥,得到GCL纯化样品,纯化步骤及有关数据见表1。

其三，解决民生短板，促进发展成果人人共享。马克思多次论述了生产资料社会占有的必然性。显然，使个人在以社会名义直接占有生产资料的基础上，能够自觉而主动地驾驭自己的社会关系，走向对社会财富、知识、权力和资源的共享，才能拓展个体发展的空间和程度。社会发展的目标是“为了一切人和完整人的发展”[17]。坚持共享发展理念，强调分配公正，“不是均等的分配，而是关注分配原则、分配形式的公平性，关注在社会成员或群体之间进行权利、权力、义务和责任配置的问题”[18]。我们应在发展中不断消除区域差距、城乡差距和收入差距，促进社会公平正义，使全体人民都能公平公正地分享与其奋斗实干相匹配的发展机遇和成果。

2.2 GCL的分子量

纯化的GCL样品经还原与非还原SDS-PAGE,都显示单一蛋白质染色带 (图4),这表明从海刺猬体腔液中分离纯化的GCL为电泳纯的单一样品,其相对分子量为94 462(图5)。与紫海胆体腔液凝集素的相对分子量为300 000,经还原、非还原SDS-PAGE测得的亚基相对分子量分别为13 000、26 000[4]以及Toxopneustidpileolus凝集素的相对分子量为32 000[5]有一定的差别。

图1 GCL第1次DEAE-纤维素52离子交换层析Fig.1 Ion-exchange chromatography of GCL on firsttime DEAE-cellulose 52 column

图2 GCL第2次DEAE-纤维素52离子交换层析Fig.2 Ion-exchange chrom atography of GCL on second time DEAE-cellulose 52 column

2.3 GCL的血凝活性

GCL对不同来源的红细胞的凝集效果不同。GCL对兔和狗红细胞的血凝活性最高,其血凝活性的对数值 (log2)均为8;对鸡红细胞次之,血凝活性的对数值 (log2)为4;对人O型血红细胞具有较弱的血凝活性,血凝活性的对数值(log2)为2;但对鲫和人A、B、AB型红细胞无血凝活性,主要原因可能是由于GCL对不同红细胞表面分子的特异性识别不同。据报道,兔红细胞对大多数凝集素敏感[17],本试验中兔红细胞对 GCL同样敏感。

表1 海刺猬凝集素的分离纯化Tab.1 Purification of the lectin from Glyptocidaris crenularis

图3 GCL Sephadex G-200分子筛凝胶层析Fig.3 Gel filtration of GCL on Sephadex G-200 column

图4 GCL的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.4 Electrophoresis of GCL on SDS-PAGE

图5 GCL在SDS-PAGE上分子量的测定Fig.5 The determ ination of molecular weight in the GCL by SDS-PAGE

表2 GCL的热稳定性Tab.2 Thermal stability of the GCL

2.4 GCL的热稳定性

GCL热稳定试验结果表明:随着温度的升高和加热时间的延长,其血凝活性会逐渐降低。GCL在温度为4～33℃时,其血凝活性最高,经36℃热处理10 min后,对兔红细胞血凝活性保留25%,经48℃加热10 min后,其活性完全丧失 (表2)。因此,GCL对温度变化较为敏感,推断蛋白质在受热后空间结构与构象的改变可能导致其血凝活性的下降和丧失。

2.5 pH对GCL血凝活性的影响

不同pH缓冲溶液对GCL血凝活性影响的试验结果表明:pH为 4.0时,无血凝活性;pH为4.5、5.0、6.0、6.5、7.0时,其血凝活性的对数值 (log2) 分别为 3、3、5、6、6;pH 为 7.5、8.0、8.5时,其血凝活性的对数值 (log2)均为8;pH为9.0、9.5、10.5时,其血凝活性的对数值 (log2)分别为6、3、3。本研究结果表明,当pH≥9.0及pH≤7.0时,GCL血凝活性开始下降,当pH为7.5～8.5时,其血凝活性最高。说明在偏碱性环境中GCL的血凝活性最高,推断这可能与海刺猬生活在弱碱性的海水环境有一定关系。

2.6 EDTA及二价金属离子对血凝活性的影响

EDTA和MgCl2对GCL血凝活性均具有抑制作用,而CaCl2对GCL血凝活性却没有抑制作用 (表3),推测GCL本身是一种Ca2+离子依赖型凝集素, Ca2+被EDTA螯合,血凝活性就明显降低,这与Ca2+对于紫海胆凝集素的血凝活性起着非常重要的作用[7]相一致。

表3 EDTA、二价金属离子对GCL血凝活性的抑制作用Tab.3 Inhibition of the GCL hemagglutinating activity by EDTA and metal ions

2.7 糖及糖蛋白对GCL血凝活性的影响

糖和糖蛋白对凝集素血凝活性的抑制中,由于它们能与凝集素分子结合,阻止其与细胞表面糖分子的结合,从而抑制凝集素的血凝活性。因此,通过糖抑制试验可知某种凝集素能与哪些或哪类糖专一性结合,这是凝集素的重要特征之一,同时也可作为凝集素分类的依据[18]。GCL血凝活性不被所测试的α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖所抑制,但被蔗糖和麦芽糖所抑制,最小抑制浓度分别为40 mmol/L和20 mmol/L。从这些单糖和二糖的结构分析推测,葡萄糖C4上的游离羟基决定血凝活性。D-葡萄糖、γ-球蛋白的C4上都有游离羟基,但GCL不被它们抑制,可能是由于D-葡萄糖、γ-球蛋白的空间构象不适合与GCL结合位点相结合,因此,不表现出对GCL血凝活性的抑制作用,据此推测GCL的结合位点可能是一个可容纳与其互补的双糖的裂隙,麦芽糖比蔗糖更有利于与GCL的结合。Toxopneustidpileolus球形叉棘凝集素是一个半乳糖专一的凝集素[5],紫海胆卵凝集素是一个半乳糖苷专一的凝集素[7],光棘球海胆体腔液凝集素为甘露糖专一的凝集素[8],均与海刺猬体腔液凝集素不同。

2.8 色氨酸的化学修饰

当NBS加入量达到100μL后,A280nm值不再下降 (图6),根据计算,GCL分子中有5.1个Trp被修饰,修饰后GCL对兔红细胞的血凝活性丧失75%(表4),表明Trp残基是GCL血凝活性的重要组成部分。

图6 GCL的NBS滴定曲线Fig.6 Titration curve of GCL by NBS

表4 N-溴代丁二酰亚胺对GCL血凝活性的影响Tab.4 The effects of NBS on hemagglutinating activity ofGCL

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Purification,properties and chem icalmodification of tryptophan residues in lectin from coelom ic fluid of
sea urchin Glyptocidaris crenularis

LIDan-tong1,2,WU Zhen-hai1,2,LIYue1,2,WANG Shu-min1,2,ZHU Ying1,2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

A lectin(GCL)was purified from coelomic fluid of sea urchin(Glyptocidariscrenularis)by DEAE-cellulose 52 ion exchange chromatography and gel filtration chromatography with Sephadex G-200.The lectin showed a single band on both reduced and non-reduced SDS-PAGE withmolecular weight of94 462,hemagglutinating the four tested erythrocytes(rabbit,dog,chicken and O type erythrocyte in human),especially to rabbitand dog erythrocytes,without hemagglutinating erythrocytes of human(A,B,AB)and crucian carp(Carassiusauratus). Themaximum hemagglutinating activity was observed at4-33℃ and at pH 7.5-8.5,being reduced to 25%at36℃ for 10 minutes.No activity was found 10 minutes after 48℃ incubation.The hemagglutination activity of GCL was significantly inhibited by divalentmetal ion Mg2+and EDTA,except for Ca2+.The hemagglutinating activity of GCL was significantly inhibited by sucrose atminimum inhibitory concentration of about40 mmol/L and bymaltose atminimum inhibitory concentration of 20 mmol/L.α-Lactose,D-Fructose,D-Galactose,D-Mannitol,D-Glucose andγ-Globulin showed little effect on the hemagglutination activity of GCL.Chemicalmodification of tryptophan(Trp)residueswith N-Bromosuccinimide(NBS)showed that 5.1 tryptophan(Trp)residuesmodified in GCL,being accompanied by 75%loss of hemagglutinating activity,indicating that Trp residues played an important part in GCL hemagglutinating activity.

Glyptocidariscrenularis;lectin;purification;chemicalmodification

S917

A

2095-1388(2012)04-0338-06

2012-05-18

辽宁省教育厅团队项目 (2008T021)

李丹彤 (1965-),女,教授。E-mail:lidantong@dlou.edu.cn