鞘内注射HPPE修饰的HEK293对骨癌痛大鼠脊髓背角pCREB表达的影响

段志祥 杨保仲 薛朝霞 郭寅南 段金纬

随着国内外诊断以及治疗技术的进步，癌症患者的生命质量已经得到很大的提高，但是癌症所引起的疼痛却使患者的生活质量大大降低。资料显示，全球每天有将近1500万患者经受癌痛的折磨[1-2]。骨癌痛是一种剧烈的、顽固性的疼痛，通常是由骨骼原发性肿瘤或者其他部位的肿瘤转移至骨，具有自发性痛、痛觉过敏和痛觉超敏的特征[3-4]。对于骨癌痛，传统的止痛药物存在不良反应多，成瘾性高的缺点。利用外源性阿片肽基因-人前脑啡肽原基因（HPPE)治疗骨癌痛则是一种新型的治疗方式。本课题组前期已将携带有HPPE基因的慢病毒载体PSB251(pLV-UbCHPPE），包装后感染HEK293细胞，筛选出稳定表达细胞pLVUbC-HPPE/HEK293(HH细胞)。以及该细胞的阴性对照细胞UbC-GFP-LV/HEK293（GH细胞)。本研究拟通过向大鼠鞘内注射HH细胞，观察其对骨癌痛大鼠行为学和脊髓背角pCREB表达的影响，探讨其镇痛作用。

1 资料与方法

1.1 动物选择以及分组 48只纯种清洁级雌性SD大鼠，体重200～220g(编号1103002)，购自河北省实验动物中心。动物饲养温度20～24℃，自由进食，饮水。实验前，动物应适应环境1周。随机分成2组，分别命名为假手术(SHAM)组（12只），骨癌痛(CIBP)组（36只）。

1.2 骨癌痛模型的制备 CIBP组大鼠麻醉后，左后肢剪毛，消毒，分离暴露左侧胫骨靠近干骺端骨面，打孔。微量进样针将5ul MADB-106大鼠乳腺癌细胞株（购自武汉大学典型培养物保藏中心）悬液缓慢注入骨髓腔内，针孔用无菌骨蜡密封，逐层消毒缝合[5]。手术过程及相关手术器械均按照无菌手术标准严格执行。SHAM组按上述手术流程向骨髓腔内注入5ul 0.9%生理盐水。术毕注意动物保温，待其苏醒后送回笼中继续饲养。

1.3 热刺激缩足反射潜伏期PWL测定及影像学观察 利用IITC39热盘仪（美国IITC Life Science 公司）行热板实验，于术前1d，术后7、14、21d测定大鼠PWL。根据Eddy和Leimbach[6]法，将热盘仪温度调节至（55.0±0.5）℃，记录自大鼠放在热盘仪至舔咬后爪时间，即热刺激缩足反射潜伏期（热痛觉阈值）。选择基础痛阈5～20s的大鼠做测量，经过热板实验筛选，反应异常鼠被剔除。每只大鼠测量3次，间隔5min，取其均值。为防止大鼠后爪被热板烫伤，确定30s的时间为其中断时间，超过30s的按照30s计算。在测试过程中应该使热板表面清洁干燥，遇到大鼠有粪便和尿液污染后应及时清除并擦净热盘。

动物麻醉后在各时点用X线对大鼠造模侧进行拍摄，观察肿瘤细胞对胫骨的侵袭破坏程度。

1.4 大鼠蛛网膜穿刺置管术 根据Storkson[7]法行蛛网膜腔穿刺：麻醉，俯卧位，腰部垫一圆筒，从两侧髂棘定位至L6，剪毛，消毒，铺无菌洞巾，沿背部正中切开约1cm，切开外筋膜，分离背脊肌，暴露L5～L6棘突间隙。挑破黄韧带以及硬脊膜，经黄韧带插入导管时，可见典型的大鼠甩尾动作。向头端置入蛛网膜下腔2cm，导管另外一端可见清亮的脑脊液流出。将导管加固于韧带上以防脱落，逐层缝合。用50ml注射器针头从大鼠背部皮下穿过至颈部，将导管从大鼠颈部引出。外露2～3cm，用热熔法封住导管外口，防止脑脊液的外漏，消毒缝皮，放回笼子单养。

1.5 鞘内注射，拮抗剂纳洛酮实验以及PWL测定 CIBP组骨癌痛模型造成后，测定PWL。随机分为三组，分别命名为CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH组，均12只。据涂会引[8]法打开鞘内置管封口，回抽有脑脊液流出，用微量注射针分别向CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH组注射PBS液，GH和HH细胞悬液各20ul，然后用15ul人工脑脊液冲入。整个给药过程慢速均匀，15s内注射完毕,封闭管口。隔天，共3次。术后密切关注大鼠情况，避免大鼠颅内高压的产生。CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH组鞘内注射后，测定大鼠PWL。

CIBP′+HH组大鼠腹腔注射纳洛酮(0.8mg/100g)，再次测定PWL。

1.6 免疫组化染色 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，大鼠仰卧位固定鼠板上，迅速剪开大鼠胸膛暴露心脏，经主动脉建立通路，依次灌入生理盐水250ml，4%的多聚甲醛500ml，待全身僵硬后解剖，取脊髓L4～L6置于4%多聚甲醛中再固定2h，入30%蔗糖脱水，过夜沉底，行冰冻冠状切片，切片厚度20um，选片，SABC免疫组织化学技术染色（即用型SABC免疫组化染色试剂盒，武汉博士德公司）：按1:1滴加5%BSA封闭液和triton x-100（AMRESCO公司，美国）。2h后加兔抗pCREB(1:100，Bioworld Technology公司，美国)，4℃冰箱孵育过夜。滴加二抗，室温孵育30min后，加入SABC（链霉亲和素-生物素-酶复合物），室温下孵育30min,DAB显色，硫酸镍胺加强显色。贴片，晾干，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。每只大鼠选取5张切片，用奥林巴斯BX51显微镜（Olympus，日本）观察脊髓背角灰质Ⅰ，Ⅱ层，pCREB免疫组化染色以细胞核内出现棕褐色颗粒细胞为阳性，用image-pro Plus6.0软件分析，测定pCREB阳性细胞数。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，p-CREB细胞计数为计量资料采用均数±标准差（χ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察 CIBP组造模术后7d、14d、21d，大鼠行为学逐渐发生改变，出现疼痛引起的自发性缩足反射，并呈进行性加重，造模侧出现活动能力逐渐下降直至拖地行走。而SHAM组左右肢未出现此种现象。

2.2 骨癌痛模型大鼠造模侧胫骨X线观察 大鼠术前1d，术后7d并未见异常情况（图B），14d可见接种的部位有放射性缺失病灶（图C)，21d显示可有骨破坏，骨皮质的缺失(图D）(见图1）。

图1 胫骨X线观察。A:术前1d，B:术后7d，C:术后14d，D:术后21d。

2.3 PWL测定 SHAM组：造模术前术后PWL相比没有发生变化。CIBP组：与术前1d PWL相比，术后7d时PWL开始下降（P<0.05)，术后14d、21d PWL值进一步下降（P<0.05)，均具有统计学意义。

注射PBS，GH细胞和HH细胞后，CIBP′+HH组PWL值与CIBP′和CIBP′+GH组相比均有了增加（P<0.05)。CIBP′+HH组大鼠腹腔注射纳洛酮后PWL与鞘内注射后的值相比降低（P<0.05)，30min后恢复（见表1、2）。

表1 大鼠骨癌痛组与对照组各时点PWL变化比较

表2 大鼠各时点PWL值变化比较（s,χ±s)

2.4 各组大鼠脊髓背角pCREB阳性细胞数表达 SHAM组脊髓背角神经元pCREB染色浅，且阳性细胞数少，为（13.87±2.76）。CIBP′组大鼠脊髓背角神经元pCREB染色较深，且阳性细胞数较多，为（54.21±5.03）。CIBP′+GH组阳性细胞数为（53.53±5.16），与CIBP′组比（P>0.05)。CIBP′+HH组阳性细胞数，为（38.73±3.92），与CIBP′组相比,大鼠脊髓背角pCREB染色变浅，阳性细胞数量也变少，pCREB表达量降低（P<0.05)(见图2）。

3 讨论

本实验首先建立大鼠骨癌痛模型。接种癌细胞7d、14d、21d后发现大鼠出现舔足，悬空等自发性痛行为，造模侧活动能力进行性下降；热板实验检测PWL明显降低；大鼠造模侧胫骨X线也表明大鼠骨癌痛动物模型成功建立。骨癌痛的具体发生机制目前仍不清楚，其本身是一种非常复杂的慢性疼痛。研究表明[9]，骨癌痛有着慢性炎症痛和神经病理性痛的一些特征，但不是两者的简单相加，有着其独自的特征。肿瘤生长过程中分泌的前列腺素、白细胞介素1、内皮素等肿瘤坏死因子，以及炎症细胞形成后分泌各种炎症因子，骨骼重建过程中溶骨细胞，破骨细胞分泌生长因子等，这些都形成了癌症微环境[9-11]。这些因子和肿瘤的压迫、坏死、缺血不断刺激神经末梢，引起初级传入神经元兴奋性升高，导致外周敏化（peripheral sensitization）[12]。胡计嬅[13]等在研究中指出：外周敏化可使大量初级传入神经元递质释放，递质作用于脊髓背角神经元上相应受体，通过多种细胞信号传导途径作用于下游底物环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白CREB,CREB发生磷酸化后被激活，促使疼痛相关基因转录。CREB通路的功能改变是慢性疼痛形成及维持的机制[14]。因此pCREB在神经损伤后在中枢和外周敏化的过程中起了重要的作用。

图2 脊髓背角pCREB免疫组化染色 (SABC法，×100倍)。

HPPE编码的是人前脑啡肽，在其翻译的过程中经不同的蛋白酶降解后形成两个内源性活性阿片肽：脑内甲硫氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽。两种阿片肽都参与了机体对疼痛信号调控，但它们并不进入细胞，而是只与神经细胞膜上的δ和μ阿片受体结合，改变痛觉传入纤维（Aδ和C纤维）对疼痛刺激信号的反应性，产生镇痛作用[15]。Atchison等[16]人的研究得出：大鼠脑室应用微量（200ng）脑啡肽就可以产生明显的镇痛效应，大鼠椎管内大剂量（10mg)应用脑啡肽也无明显的呼吸循环功能障碍，证明其安全系数很高。蛛网膜下腔移植HPPE修饰细胞可以有效改善神经性疼痛，其镇痛效应通过阿片受体介导[17]。

血脑屏障能控制进入中枢神经系统的物质，尤其对水溶性化合物通透性很低，使免疫调节分子及免疫活性细胞等不能通过，难以发生免疫应答[18]。蛛网膜下腔的免疫功能相比其他组织对外源细胞的免疫排斥要弱。鉴于此，本课题组前期实验用人来源的HEK293细胞作为工具细胞，通过构建含有人前脑啡肽原基因（HPPE）的慢病毒载体，经过包装后，感染，筛选出稳定表达该基因的HEK293细胞。将该细胞注射到大鼠蛛网膜下腔观察其对大鼠骨癌痛的影响。远期目标是将该细胞注入到骨癌痛病人的蛛网膜下腔观察能否产生满意的骨癌痛镇痛效果。

本实验结果显示鞘内注射HH细胞后，改变了骨癌痛大鼠行为学并降低了慢性疼痛CREB传导通路中脊髓背角pCREB的表达。说明鞘内注射该细胞后，在癌痛大鼠蛛网膜下腔存活且表达了少量的人前脑啡肽，对骨癌痛起到了一定镇痛作用，且镇痛效果可以被纳洛酮拮抗。实验过程中也发现虽然大鼠PWL增加，但pCREB表达减少程度并不明显，说明目的基因表达不是十分理想。原因可能是：虽然血脑屏障对免疫调节分子和免疫活性细胞通透性低,但在病理状态下[19]，处在骨癌疼痛当中的大鼠血脑屏障有可能出现通透性增高；或可能在行蛛网膜下腔穿刺置管时，将大鼠血液带入蛛网膜下腔，而血液中存在相应的免疫分子，导致外源细胞被免疫。因此，该细胞能否长期存活并持续分泌镇痛物质，仍需进一步研究。

另外，利用携带HEEP的慢病毒载体，包装后，收集假病毒颗粒直接注射大鼠蛛网膜下腔，使其感染大鼠细胞，使目的基因整合到大鼠细胞并稳定表达HEEP，观察是否能产生持续的骨癌镇痛作用，这也是本课题下一步的研究目标。

综上所述，大鼠慢性骨癌痛可导致其热痛阈值降低，脊髓背角pCREB表达增加，而通过鞘内注射HPPE基因修饰的HEK293细胞后，可使大鼠热痛阈值提高，脊髓背角pCREB表达降低，表明该重组细胞对大鼠骨癌痛有镇痛效果，其镇痛机制可能与抑制pCREB的表达有关。

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