两个蛹虫草菌株的人工栽培试验比较

田雪梅

(山东省应用真菌重点实验室 青岛农业大学,山东 青岛 266109)

蛹虫草 (Cordycepsmilitaris(Fr.)Link)又名北冬虫夏草、蛹草、北虫草、蛹草菌,分类学上属于真菌门 (Eumycota),子囊菌亚门 (Ascomycotinia),核菌纲 (Pyrenomycetes),球壳目 (Sphaeriales),麦角菌科 (Clavicip tiaceae),虫草属 (Cordyceps),是虫草菌寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体及幼虫上形成的虫菌复合体[1～2]。

蛹虫草与冬虫夏草在生物学上为同一个属,有相同或十分相似的化学成分,而且蛹虫草的虫草素、K、Ca、Se、维生素等对人体有益的成分含量高于野生冬虫夏草。大量的药理药化试验及临床实践证明,蛹虫草与野生冬虫夏草对人体具有相同或相似的功能。随着对虫草认识不断深化,国内以及东南亚、日本、美国等国际的市场需求量都在不断增加。所以进一步加强对蛹虫草的全面深入研究是十分必要的[3]。

为比较本研究所保藏的两个蛹虫草菌株在栽培、产量及有效成分含量等方面的差异,设计了以下试验。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 蛹虫草1号,蛹虫草2号,均由山东省应用真菌重点实验室(青岛农业大学)提供。

1.2 培养基配方 培养基A:大米50 g,蚕蛹粉2.5 g,营养液50 mL;培养基B:大米50 g,蚕蛹粉5 g,营养液50 mL。其中两个配方的营养液配方均为:蛋白胨0.5%,葡萄糖1%,MgSO40.05%,KH2PO40.1%。

1.3 试验设置 分别对供试的4个处理编号为:1A、2A、1B、2B。其中数字1为蛹虫草1号,2为蛹虫草2号。

1.4 试验方法

(1)培养基制作。选用500 mL罐头瓶,每瓶装大米50 g,添加适量蚕蛹粉,再加营养液,轻轻拌匀。用高压聚丙烯薄膜和皮筋包扎封口,121℃、高压蒸汽条件下灭菌30 min。

(2)液体菌种的制备。无菌操作,取0.5 cm2斜面母种菌种块6～7块,接入装有200 mL PDA液体培养基的500 mL三角瓶中。接种后,置20℃、180 r/min条件下,震荡培养4天,作为液体菌种备用。

(3)栽培瓶接种。按无菌操作,用移液枪吸取7 mL液体菌种接种到经灭菌的栽培瓶中。将接种完毕的栽培瓶置于20℃栽培室中避光培养。

(4)发菌管理[4～6]。蛹虫草菌丝生长的适宜温度为10～25℃,开始的3～4天发菌室控制在18～20℃,以后将温度调整到22～25℃。保持室内空气湿度在65%左右。发菌前1周可不通风,中后期适当通风换气,以后每两天或每天通风1次,每次30～40 min。菌丝生长阶段不需要光线,避光培养。培养19天,菌丝长满瓶后,继续在黑暗条件下培养3～4天,促使菌丝后熟,为后面的出草打好基础。

(5)转色期管理 (催蕾管理)[7]。将发满菌丝的栽培瓶分层排放在架上,进行转色管理。每天早晨8时开始通风见光,每天光照时间不少于12 h,光照强度200 lx左右。利用10～20℃昼夜温差进行连续温差刺激,转色期2～8天,等到菌丝全部由白色转为黄色后,每天1～2次于地面喷洒雾状水,保持湿度85%～95%。料面上会很快形成小米粒状菌蕾。

(6)生长阶段管理[8]。控制温度范围为19～25℃。初期空气相对湿度控制在80%左右,待子实体长出1 cm后,将空气湿度提高到90%。出草期间用喷雾器向地面及墙壁四周喷水以提高湿度。在整个生长过程中,不需要去掉封口薄膜。当蛹虫草长到约1 cm高时,用粗针或竹签在封口薄膜上扎几个孔以增加通气量。此阶段主要靠自然散射光照,避免强光直射。

(7)采收。按照上述管理,待蛹虫草子实体长到长度为5～8 cm时为成熟,去掉封口薄膜,用镊子将子实体从培养基上摘下或轻轻拔出。

(8)营养成分的测定。蛹虫草子实体及培养料中总糖含量的测定采用蒽酮硫酸法[9],还原糖测定采用DNS法[10],多糖含量=(总糖-还原糖)×0.9。虫草酸含量的测定采用比色法[10～11]。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草生长变化 培养19天左右,白色菌丝体布满整个培养基,继续培养3天后见光。见光初期菌丝为白色绒毛状,长势健壮,经自然光照射,可以产生黄色色素;见光2～8天,菌丝由白色逐渐转为橘黄色或橘红色。菌丝分泌色素后,培养基表面即出现米粒状的橘黄色菌蕾。

雏形子实体经过15～20天的生长,不断抽长,顶端稍微膨大呈棍棒形。虫草膨大部分形成子座,子座周围产生许多小粒点 (子囊壳颈部和孔口)。这时子座已经成熟 (即虫草成熟),应及时采收。

子实体生长密集的地方,其个体的直径比较小;反之,在生长稀疏的地方,子实体比较粗。虫草有较强的趋光性,如果出现子实体倒向一边,应调整室内光源方向,或调整瓶的方向,以保证子实体生长形态正常。

蛹虫草1号生长停止后,顶端出现许多小刺,手触不光滑,头部出现龟裂状花纹,表面可见黄色粉末状物,子实体易断。而蛹虫草2号子实体光滑,有韧性,不易折断,以致区别。

2.2 子实体 (虫草)采收和处理 大米培养基栽培的蛹虫草,见表面有橘黄色粉末状物质出现时表明子实体停止生长,应立即采收。采收时,各处理分别取5瓶,将子实体根部整理干净,及时置于60℃下烘干、称重,计算各处理的生物转化率(图1)。

图1 4个蛹虫草处理生物转化率测定

从图1可以看出,蛹虫草2号菌株的生物转化率显著高于1号菌株;对同一菌株,A培养基显著高于B培养基。

2.3 蛹虫草子实体和培养料中多糖含量的测定蛹虫草子实体及培养料中多糖含量测定结果及差异显著性分析结果如表1所示。从表1可知,蛹虫草1号的多糖含量显著高于蛹虫草2号。同一菌株,其子实体中的多糖含量一般高于培养料中的多糖含量。相对来说,培养料中的多糖含量也还比较高,可考虑再次出草。

2.4 蛹虫草子实体及培养料中虫草酸含量的测定从各处理蛹虫草菌丝体提取液中虫草酸的含量及其差异显著性分析结果 (表1)可以看出,各处理间均存在极显著差异,蛹虫草2号虫草酸的含量明显高于蛹虫草1号;培养料中虫草酸含量一般低于子实体中的含量,但其含量尚可,仍应加以利用,以提高虫草酸的提取和利用率。而2A子实体中虫草酸含量则较高,达到7.39%,与其他处理间存在极显著差异。

3 讨论与结论

本试验所得虫草多糖含量最低为12.21%,最高为22.77%,明显高于李颜等所测得的虫草多糖含量9.05%、8.52%、18.0%、 10.03%、11.3%、5.07%[10]。而虫草酸的含量则明显低于蔡友华等测得的巴西虫草菌丝体中虫草酸的含量8.45%[11],与李颜等所得的不同蛹虫草中虫草酸含量 6.58%、4.28%、4.25%、2.39%、5.89%、4.71%[10]相近。

表1 蛹虫草中多糖含量与虫草酸含量的测定结果

由试验结果可以看出,在虫草多糖、虫草酸含量上,相同的菌株,一般子实体含量高的,其对应的培养料中含量也较高。蚕蛹粉的加入量对虫草其他有效成分的影响还有待于进一步研究。出草后培养料中尚存大量多糖和虫草酸,可考虑继续培养再次出草,亦可直接利用培养料进行有效成分提取。综合考虑生物转化率、多糖及虫草酸含量等的试验数据,认为2号蛹虫草菌株与培养基A的组合具有明显优势,可应用于生产实践。

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