幽门螺杆菌rdxA和cagA基因突变与甲硝唑耐药的相关性研究Δ

张 姝，莫 非，张 然，孙朝琴，王 莹，李 寅，罗昭逊，夏曙华（贵阳医学院临床检验教研室，贵阳550004）

幽门螺杆菌（Hp）是慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病因素，与胃癌和胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关[1]。目前使用抗菌药物根除Hp感染是治疗Hp相关性胃炎、消化性溃疡的主要方法。抗菌药物的广泛使用使Hp对抗菌药物的耐药性不断升高，其中对甲硝唑（MTZ）的耐药性尤为突出[2]。国外有学者Goodw in等[3]报道，Hp的编码基因（rdxA）变异与甲硝唑耐药有一定关系，但Hp对甲硝唑的耐药机制目前尚未完全明确。细胞毒素相关基因A（cagA）编码的产物是Hp重要的毒力因子，不仅与Hp致病及相关疾病临床严重程度有关，还可能与甲硝唑的耐药性有关，但是相关关系目前尚有分歧。由于基因本身的多态性和药物选择压力下的遗传多样性，单纯的聚合酶链式反应（PCR）难以完全阐明基因中的复杂信息。为了观察DNA中碱基突变，本试验对从贵阳某医院60例消化内科患者胃黏膜标本中分离出的11株Hp的rdxA和cagA基因进行PCR扩增并测序，与国际标准株Hp26695碱基序列比对，探讨二者碱基突变与甲硝唑耐药性的关系。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Chem iDoc XRS凝胶仪（美国Bio-Rad公司）；PCR扩增仪（美国Applied biosystems公司）；DNA提取试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司）。

1.2 试药

哥伦比亚血琼脂（英国Oxoid公司）；脱纤维羊血（广州蕊特生物科技有限公司）；甲硝唑E试验（E-test）试纸条和微需氧袋（法国生物梅里埃公司）；万古霉素、两性霉素、多粘霉素、三甲氧苄氨嘧啶（TMP）原料药（美国Sigma公司，批号：V2002、A9528、S0414、T7883，纯度均为：98%）。

1.3 菌株

国际标准株Hp26695购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），由贵阳医学院临床检验教研室保存。Hp临床分离株均分离自贵阳某医院60例消化内科患者胃黏膜标本。该60例患者因胃部不适行胃镜检查，标本取自胃窦部或胃体部黏膜，并经尿素碳（14C）呼气试验阳性鉴定后，进行Hp的分离培养所得。

2 方法

2.1 分离培养

取胃黏膜标本，接种于哥伦比亚血琼脂平板，37℃微需氧袋培养72～96 h后，经革兰氏染色镜检和过氧化氢酶、氧化酶、尿素碳（14C）呼气试验均阳性鉴定为Hp后，进行增菌及传代培养，－80℃保存。

2.2 药敏试验

采用E-test法检测Hp对甲硝唑的最低抑菌浓度（M IC）。将细菌制备成1×108cfu·m L－1浓度的菌液，均匀涂布于哥伦比亚血琼脂平板上，贴上甲硝唑药敏试纸条，37℃微需氧培养72 h。以M IC≥8 μg·m L－1判定为甲硝唑耐药，M IC≥32 μg·m L－1判定为高水平甲硝唑耐药，试验重复3次[4]。

2.3 Hp基因组DNA提取

按DNA提取试剂盒说明提取Hp基因组总DNA。用紫外分光光度计对提取的DNA纯度进行测定，计算260 nm和280 nm波长处的光密度比值（OD260nm/OD280nm），当比值≈1.8时，即认为DNA纯度较高[5]。

2.4 PCR扩增

根据文献[6]提供的引物序列合成特异性的引物，rdxA和cagA基因引物序列具体见表1。

表1 rdxA和cagA基因引物序列Tab 1 Primersof rdxA geneand cagA gene

采用PCR扩增，反应体系为50µL，包括超纯水19µL，上、下游引物各2µL，模板DNA 2µL，扩增酶Primix Taq 25µL。cagA扩增条件：94℃预变性5m in，之后变性30 s，51～52℃褪火，72℃延伸2min，最终延伸10min。rdxA扩增条件：94℃预变性5m in，之后变性30 s，53.7℃褪火，72℃延伸2m in，最终延伸10m in。每次扩增时均设标准株Hp26695作为阳性对照，未加模板的PCR扩增作为阴性对照。反应完毕后取PCR产物2µL，置于1.0%琼脂糖凝胶孔中电泳检测PCR产物。

2.5 产物序列分析

将“2.4”项下得到的PCR产物送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序。测序结果用BLAST软件进行碱基序列分析。

3 结果

3.1 Hp的培养与药敏结果

从60例患者胃黏膜标本中共分离出Hp临床分离株11株。采用E-test法测定该11株Hp临床菌对甲硝唑的M IC均≥256 μg·m L－1，表明其均为甲硝唑高耐药株。

3.2 DNA提取结果

11株Hp临床分离株与标准株Hp26695的DNA纯度经紫外分光光度计检测，OD260nm/OD280nm均在1.75～1.8之间，表明其DNA纯度均较高。

3.3 PCR扩增结果

11株临床分离株和标准株Hp26695的rdxA和cagA基因均分别在750 bp和260 bp位置出现特异性条带，rdxA和cagA基因的扩增率均为100%，具体扩增电泳图见图1、图2（图中，阴：阴性对照，阳：标准株Hp26695，M：marker）。

图1 Hp临床分离株的rdxA扩增电泳图Fig 1 Am p lified electrophorogram of rdxA gene of clinical isolated Hp

图2 Hp临床分离株的cagA扩增电泳图Fig 2 Am plified electrophorogram of cagA gene of Hp clinical isolated HP

3.4 产物测序结果

11株Hp临床分离株与标准株Hp26695相应基因序列比对后发现：11株Hp临床分离株均含有rdxA和cagA基因，其核苷酸同源性分别为95%～98%、86%～94%，2基因分别有4、10个规律性突变。11株临床分离株rdxA和cagA基因的相同突变位点和突变形式见表2。

表2 11株Hp临床分离株rdxA和cagA基因的相同突变位点和突变形式Tab 2 Samemutations sites and form of rdxA gene and cagA gene in 11 strainsof clinical isolated Hp

4 讨论

甲硝唑是硝基咪唑类药物，有较强的抗Hp活性，是三联方案中最广泛应用的抗菌药物之一。随着抗菌药物的广泛使用，Hp对甲硝唑的耐药率呈逐年上升趋势，是导致含甲硝唑方案治疗Hp感染失败的主要原因。本试验从60例患者胃黏膜标本分离出11株Hp，其cagA基因全部为阳性，并且对甲硝唑的M IC均≥256μg·m L－1，表明全部为甲硝唑高耐药株。

甲硝唑耐药与rdxA基因有较为密切的关系。rdxA基因的插入、缺失导致下游翻译终止密码子的提前产生，rdxA蛋白合成提前终止；而碱基转换、颠换突变直接导致氨基酸替换，这些突变均有可能导致rdxA蛋白构象发生改变，致使rdxA蛋白活性下降或失活而产生甲硝唑耐药[7]。本研究中11株Hp临床分离株均发生插入、缺失和碱基转换3种突变类型，以碱基转换为突变的主要类型，只出现单个碱基插入或缺失，未发现大片段序列插入或缺失，即均表现为点突变。本试验发现rdxA基因变异位点大多不固定，但11株临床分离株存在4个固定的突变位点，即均发生了1013598位点A→G、1013619位点G→A、1013961位点C→T、1014149位点A→G。这些位点的改变均未见文献报道，笔者推测这些位点的突变与甲硝唑的耐药可能有密切的关系，实际情况有待于增加临床菌株数后再进一步的证实。

Hp菌株的基因型不同是导致感染后临床结果不同的重要因素之一。cagA基因是Hp重要的毒力因子，可以作为评价Hp毒力的指标。研究[8]表明，Hp菌株中约有45%以上含有cagA基因，cagA阳性患者的消化道溃疡和胃癌的发生率明显升高，并且cagA阳性与疾病严重程度呈正相关。本试验11株Hp临床分离株均扩增出cagA基因，其与标准株Hp26695相应基因序列相比同源性低于94%，序列间存在碱基的插入、缺失和替换。这可能与cagA基因的编码区和非编码区都存在多样性有关。谢国艳等[6]报道Hp高耐药菌中cagA阳性菌株的rdxA基因突变率明显高于cagA阴性菌株，并推测cagA阳性Hp菌株的rdxA基因突变与甲硝唑产生高水平耐药可能有一定关系。该报道和本研究结果有相似之处。

研究Hp对甲硝唑的耐药机制为个体化用药以及为选择合适的抗菌药物用于临床治疗奠定了基础。本研究提示，Hp对甲硝唑耐药性不仅可能与rdxA基因突变有关，亦可能与cagA基因相关。在后续的研究中，笔者将增加样本量，运用基因组学和蛋白质组学方法对其进行验证。

[1]Cover TL，BlaserMJ.Helicobacterpylori in health and disease[J].Gastroenterology，2009，136（6）：1 863.

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[4]Jeong JY，Mukhopadhyay AK，Dailidiene D，etal.Sequential inactivation of rdxA（Hp0954）and frxA（Hp0642）nitroreductase genes causesmoderate and high-levelmetronidazole resistance in helicobacter pylori[J].Journal of Bacteriology，2000，182（18）：5 082.

[5]徐克前.分子生物学检验技术实验指导[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2005：22.

[6]谢国艳，高志生，胡嘉波，等.耐甲硝唑幽门螺杆菌cagA基因检测与rdxA基因突变研究[J].临床检验杂志，2010，28（3）：204.

[7]Matteo MJ，Pérez CV，Dom ingo MR，etal.DNA sequence analysis of rdxA and frxA from paired metronidazolesensitive and resistant helicobacter pylori isolates obtained from patientsw ith heteroresistance[J].Int JAntimicrob Agents，2006，27（2）：152.

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