江南卷柏中的黄酮碳苷类成分研究Δ

朱田密，陈科力，黎莉（1.湖北中医药大学省部共建中药资源与中药复方教育部重点实验室，武汉430065；2.湖北省中医院药事部，武汉 430061；3.武汉工程大学化工与制药学院，武汉 430073）

江南卷柏（Selaginella moellendorffiiHieron.）是卷柏科卷柏属药用植物，多年生草本，具有清热利湿、止血之功效[1]。已知其化学成分有异茴芹素、银杏素等[2，3]。卷柏属含有丰富的双黄酮类化合物，而黄酮碳苷很少报道，史社坡[4]2003年首先从卷柏中得到了芹菜素-6，8-二-C-β-葡萄糖苷；笔者于2008年在硕士学位论文中报道在江南卷柏中发现了4种黄酮碳苷[5]；申健2010年的硕士学位论文中亦报道从布朗卷柏中分离得到了芹菜素6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷以及芹菜素6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷[6]。本文详细报道3种黄酮碳苷的提取分离方法和结构鉴定过程。

1 仪器与试药

INOVA600核磁共振仪（美国Varian公司）；7.0T傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（美国IonSpec公司）；U-2001紫外分光光度计（日本Hitachi公司）；5700FFIR红外分光光度计（美国Nicolet公司）；P680高效液相色谱仪（美国Dionex公司）。

江南卷柏全草于2005年7月采自湖北恩施，由湖北中医药大学陈科力教授鉴定为江南卷柏Selaginella moellendorffiiHieron.，标本留存于湖北中医药大学中药标本中心。聚酰胺粉（60～100目，武汉药科新技术开发有限公司）；Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia公司）；聚酰胺薄膜（20×20 cm，浙江台州路桥四青生化材料厂）；薄层色谱硅胶G（青岛海洋化工厂）；其他试剂均为分析纯。

2 提取与分离

江南卷柏干燥全草12 kg，切段，依次用15倍量95%、90%、80%乙醇各提取3 h，滤过，减压回收乙醇，浓缩成浸膏，用蒸馏水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，得到正丁醇部位浸膏120 g。取正丁醇部位浸膏113 g，上样于聚酰胺柱（60～100目，86 cm×9 cm），以不同浓度的水-乙醇梯度洗脱，每500 mL为一流分，共收集279份流分，用硅胶G薄层和聚酰胺薄膜检识，合并相同流分，得28个部分（Fr1～Fr28）。取Fr6（纯水洗脱部分）、Fr7（5%乙醇洗脱部分）经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇，60 cm×2.2 cm）纯化，流分结晶后得化合物Ⅰ（40 mg）；采用相同方法，Fr9（10%～15%乙醇洗脱部分）纯化得复合结晶Ⅱ和Ⅲ（16 mg）。此外，Fr8（10%乙醇洗脱部分）和Fr10（15%乙醇洗脱部分）经过Sephadex LH-20柱色谱后，再用半制备高效液相色谱分离，亦得到复合结晶Ⅱ和Ⅲ（10mg）。

3 结构鉴定

化合物Ⅰ：淡黄色粉末（甲醇），UV（MeOH）λmax：272、333 nm；IR（KBr）νmax：3 383（br，OH）、2 927（CH2）、1 651（Ar-C＝O）、1 626、1 574、1 511、1 481（芳环骨架振动）、829（苯环对位二取代）cm－1；HR ESI-MS（m/z595.1 657[M+H]+，计算值595.1 663）推断分子式为C27H30O15（Ω＝13）。三氯化铁反应阳性，喷三氯化铝显色剂于紫外光灯下显黄色荧光，提示可能为黄酮类化合物；氨气熏后黄色荧光不变亮，为黄酮苷；常规酸水解条件下不能被水解，表明为碳苷。其核磁共振氢谱（1H-NMR，DMSO-d6，600 MHz）见表1；核磁共振碳谱（13C-NMR，DMSO-d6，150 MHz）见表2。δC低于140的碳原子数有6个，说明黄酮母核除C-2、C-4、C-9外，还有3个碳原子连有氧原子，这和1H-NMR中显示3个-OH信号相符。糖基碳原子δ低至81，是碳苷的表现。HSQC中δC73.9、73.2分别与δH4.81（1H，d，J＝10.8 Hz）、4.76（1H，d，J＝10.2 Hz）相关，是2个碳苷端基C、H信号。根据13C-NMR中的12个糖碳信号，DEPT谱δC59.7、61.2显示的2个CH2，1H-NMR中糖基所有氢原子的偶合常数JH-H值都大于5Hz以及2个端基氢的偶合常数（J＝10.8 Hz，10.2 Hz），说明2个糖单元都为β-D-吡喃葡萄糖，并且各自连在母核上。HMBC中端基H-1″与母核C-5、C-6、C-7远程相关，端基H-1′″与母核C-7、C-8、C-9远程相关，表明2个糖基分别连在母核C-6和C-8位；另有远程相关信号确定了3个-OH取代位置在母核C-5、C-7、C-4′位。综合上述分析，并与文献对照[7]，确定其为芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷。

复合物Ⅱ和Ⅲ：黄色粒状结晶（甲醇），UV（MeOH）λmax：272、330 nm；三氯化铁反应阳性，三氯化铝反应紫外光灯下显黄色荧光，提示可能为黄酮类化合物；其1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）见表1；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）见表2。糖基碳原子δC低至81，表明为碳苷。δC59～81有22个C信号（δC70.3为重叠），表明有4个糖基（2个六碳糖和2个五碳糖）。HMQC可确定4个端基C-H：δC75.2、73.6、74.9、73.9分别与δH5.02（1H，d，J＝9.0 Hz）、4.74（1H，d，J＝9.6 Hz）、4.65（1H，d，J＝9.0 Hz）、4.55（1H，d，J＝9.6 Hz）相关。4个端基碳都处于较高场δC73～75，说明4个糖基与母核以碳键相连，为碳苷。端基氢的偶合常数（J＝9.0 Hz，9.6 Hz）说明4个糖基都是β构型；DEPT谱显示 4 个CH2：δC59.7、61.2、70.3（2个CH2叠加），1H-NMR（600 MHz）任意2个H的JH-H值都不小于3 Hz，以及表2数据表明4个糖基为2个β-D-吡喃葡萄糖和2个β-D-吡喃木糖[8～10]。母核碳信号个数为24（部分重叠），大于15，且多数信号成对出现，提示分子中可能含有2个黄酮单元，或者是2个化合物的复合物。据HMBC糖端基H与母核C-6、C-8位的远程相关，确定了4个糖基分别连在母核上的6，8位；结合HMQC，1H-NMR确定了C-5、C-7、C-4′位有-OH取代，C-3位有H。因所有位置均有归属，2个黄酮单元无处相连，判断其为一对同分异构体复合物。这个判断经质谱得到了证实：HR ESI-MS在300～1 300分子量范围内只显示一个准分子离子峰（m/z563.1 395[M-H]－，计算值563.1 401），证实了该晶体是一对分子式为C26H28O14（Ω＝13）的同分异构体，确定其为芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷和芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷的复合物。化合物结构式及HMBC相关性表达见图1。

表 1化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的 1H-NMR 数据（600 MHz，（J）HzDMSO-d6）Tab 1 1H-NMR data of compoundⅠ、Ⅱ、Ⅲ（600 MHz，（J）Hz，DMSO-d6）

表2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的13C-NMR数据（150 MHz，DMSO-d6）Tab 2 13C-NMR data of compoundⅠ、Ⅱ、Ⅲ（150 MHz，DMSO-d6）

4 化合物抑制环氧化酶（COX-2）活性测试

图1 化合物结构式及HMBC相关性表达Ⅰ.芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷；Ⅱ.芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷；Ⅲ.芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷Fig 1 Structures and key correlations for compoundsⅠ.6，8-di-C-β-D-glucopyranosylapigenin；Ⅱ.6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranosylapigenin；Ⅲ.6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranosylapigenin

选择化合物Ⅰ进行抑制COX-2的活性测试。参照文献方法[11]，将化合物Ⅰ作用于培养的人结肠癌细胞（HT-29），配成不同浓度的试验组（终浓度分别为12.5、25.0、50.0 μg·mL－1），同时设空白对照组、阳性对照姜黄素组（3.125 μg·mL－1）做对比，继续培养，提取总RNA。采用RT-PCR技术检测药物作用前、后HT-29细胞中COX-2 mRNA的表达，扩增产物的电泳结果见图2。以灰度值即COX-2 275bp电泳带与内参β-actin 234 bp电泳带的吸光度值的比值来反映COX-2 mRNA的相对含量（计算公式：COX-2 mRNA灰度值＝COX-2 mRNA密度/β-actin mRNA密度）（见表3）。结果，样品组的灰度值与其浓度之间呈负相关，相关系数为－0.944，说明化合物Ⅰ可在mRNA水平抑制HT-29COX-2的表达。

图2 电泳图M.DL2000 DNA Marker；1.空白对照组；2.阳性对照姜黄素 3.125 μg·mL－1；3.化合物Ⅰ 12.5 μg·mL－1；4.化合物Ⅰ 25.0 μg·mL－1；5.化合物Ⅰ50.0 μg·mL－1Fig 2 ElectrophoretogramM.DL2000 DNA Marker；1.blank control group；2.curcumin positive control 3.125 μg·mL－1；3.compoundⅠ 12.5 μg·mL－1；4.compoundⅠ25.0 μg·mL－1；5.compoundⅠ 50.0 μg·mL－1

表3 灰度值测定结果Tab 3 Results of gray scale determination

5 讨论

除以上3种黄酮碳苷外，笔者还从江南卷柏正丁醇部位分离鉴定了一个新的黄酮氧苷：系由上述聚酰胺柱色谱40%乙醇洗脱部分，经Sephadex LH-20柱（甲醇）纯化、结晶而得（51 mg），经理化性质和波谱分析，鉴定为5-羧甲基-4′-羟基-黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，是首次发现的5-羧甲基取代的黄酮类型，这一研究发表在Chinese Chemical Letters[12]；之后，这一黄酮类型又有新发现：Cao Y[13]等2010年从江南卷柏、申健[6]从布朗卷柏中分别发现了新化合物：5-羧甲基-4′，7-二羟基黄酮，Cao Y等[13]还得到了它的乙酯和丁酯，也是2个新化合物并具抗乙型肝炎病毒活性。申健[6]还分离得到了与江南卷柏相同的成分：4′-羟基-5-羧甲基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。至此，卷柏属中已报道了4种5-羧甲基取代的黄酮类化合物。

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