蟾酥注射液对HL60/ADM细胞多药耐药的逆转作用研究

熊新，周远大（1.重庆医科大学附属第一医院实验研究中心，重庆400016；2.重庆医科大学附属第一医院药剂科，重庆 400016）

白血病细胞的多药耐药（Multidrug resistance，MDR）是指白血病细胞同时对多种结构和不同作用机制的抗肿瘤药物产生耐受，从而使化疗失败或复发[1，2]。因此，寻求一种能逆转其MDR的药物对提高化疗效果，延长病人生存期是十分关键的。目前已发现多种药物具有逆转MDR的作用，但大多数逆转药物当达到其逆转浓度时，其毒副作用明显[3，4]，从而大大限制了这些逆转药物的临床应用，近年来研究者们试图从传统中医药的角度寻找逆转白血病MDR的新药[5，6]。

蟾酥是我国传统的中药材，有改善全身状况、提高机体免疫功能和提升白细胞等作用，同时还具有一定的抗肿瘤的功效，主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥其疗效。李贵新等[7]研究发现，蟾酥注射液能够抑制白血病HL60细胞的增殖并诱导其凋亡，但其作用机制尚不明确。本研究旨在探讨蟾酥注射液逆转耐阿霉素（ADM）的急性髓性白血病细胞（HL60/ADM）MDR的作用及其机制，以期为治疗白血病提供新的辅助药物。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CO2培养箱（美国Shel Lab公司）；全自动酶标读数仪（美国Biorad公司）；96孔培养板（美国Corning公司）；高效液相色谱（HPLC）仪（美国PerkinElmer公司）。

1.2 试药

蟾酥注射液（江苏安格药业，批号：0001208，浓度：1.65 μg·L－1）；ADM标准品（浙江海正药业，批号：H33021980，浓度：100 μg·mL－1）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；MTT（美国Sigma公司）；新生胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈（分析纯，上海陆都化学试剂厂）。

1.3 细胞株

ADM诱导的人急性髓性白血病耐药细胞株HL60/ADM由中国医学科学院血液学研究所提供。

2 方法

2.1 细胞培养

HL60/ADM细胞株置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养。培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度，每2～3 d传代1次，培养基中加入ADM，使其最终浓度为0.2 μg·mL－1，以维持细胞的耐药性，使用前1周停加ADM。取对数生长期细胞进行试验。

2.2 MTT法检测蟾酥注射液对HL60/ADM细胞增殖能力的影响

制备HL60/ADM细胞悬液（5×104个/mL），并接种于96孔板中，每孔200 μL。分别加入不同浓度蟾酥注射液20 μL（终浓度分别为0.015、0.030、0.060、0.120、0.150 μg·mL－1），每个浓度设3个平行孔，并设空白对照。在CO2孵箱中培养72 h后，每孔加入 5 mg·mL－1MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，弃上清液，加入150 μL DMSO，震荡10 min使其充分溶解，然后用自动酶标仪测定各孔吸光度（A），试验重复3次，取平均值。按下式计算细胞存活率（fu）：fu＝处理组平均A值/对照组平均A值。

2.3 MTT法检测蟾酥注射液对HL60/ADM细胞MDR的逆转作用

试验分为对照组和处理组，对照组加空白培养液，处理组一次性加逆转浓度的蟾酥注射液诱导培养3 d，并停药培养7 d，每3 d换液1次。将对照组和处理组细胞分别制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200 μL。依次加入含不同浓度ADM，每孔20 μL，使ADM的终浓度分别为2.49、4.99、9.96、18.95、39.90 μg·mL－1，每个浓度设3个平行孔，并设空白对照组加入等体积培养液。在CO2孵箱中培养72 h后，同“2.2”项下方法测定各孔A值，试验重复3次，取平均值。并计算细胞抑制率（fa，fa＝1－fu）和半数抑制量（IC50）。

2.4 HPLC法测定细胞内、外ADM的浓度

2.4.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：5 mmol·L－1；流动相：磷酸-甲醇-异丙醇-乙晴（8∶7∶3∶2）；流速：1 mL·min－1；柱温：30 ℃；荧光检测激发波长：480 nm，发射波长：560 nm。

在选定的色谱条件下，测得ADM标准品、培养液和细胞内液中的ADM色谱，被测物与其他杂质分离完全，峰形良好，保留时间约为5.8 min。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.ADM标准品；B.空白培养液；C.空白细胞内液；D.培养液中ADM标准品；E.细胞内液中ADM标准品；F.培养液中ADM样品；G.细胞内液中ADM样品；1.阿霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.ADM control；B.blank culture medium；C.blank intracelluar fluid；D.ADM control in culture media；E.ADM control in intracelluar fluid；F.ADM in culture media；G.ADM in intracelluar fluid；1.ADM

2.4.2 细胞样品处理 试验分为对照组和处理组，对照组加空白培养液，处理组一次性加逆转浓度的蟾酥注射液诱导培养3 d，并停药培养7 d，每3 d换液1次。将对照组和处理组细胞分别制成浓度为106个/mL的细胞悬液，接种到6孔板中，加入ADM使最终浓度为345 μmol·mL－1。在加药后1、3、6 h分别收集培养上清液和细胞内液，每组3份。取培养上清液或细胞内液0.5 mL，置于1.5 mL离心管中，加入乙腈0.5 mL，快速混匀1 min，超声振荡10 min，12 000 r·min－1离心15 min，取上清液10 μL注入液相色谱仪进行分析，记录峰面积。

2.5 方法学验证

2.5.1 培养液-ADM标准曲线的制备 取0.5 mL空白培养液数份，在ADM标准品粉末中加入不同量蒸馏水，制备浓度为160、80、40、20、10、5 μg·mL－1的ADM培养液样品各5份，按“2.4.2”项下“取培养上清液”开始操作，进行HPLC分析。以培养液中ADM检测浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝39.649X+3.432 8（r＝0.999 8）。结果表明，培养液中ADM检测浓度在5～160 μg·mL－1范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系，检测限为0.1 μg·mL－1（S/N＝5）。培养液-ADM标准曲线见图2。

图2 培养液-ADM标准曲线Fig 2 The calibration curves of adriamycin in cell culture media

2.5.2 HL60/ADM细胞内液-ADM标准曲线的制备 取0.5 mL空白细胞液数份，在ADM标准品粉末中加入不同量蒸馏水，制备浓度为160、80、40、20、10、5 μg·mL－1的ADM细胞样品各5份，按“2.4.2”项下“取培养上清液”开始操作，进行HPLC分析。以HL60/ADM细胞内液中ADM检测浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝41.465X－40.751（r＝0.999 8）。结果表明，HL60/ADM细胞内液中ADM检测浓度在5～160 μg·mL－1范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系，检测限为0.1 μg·mL－1（S/N＝3）。HL60/ADM细胞内液-ADM标准曲线见图3。

图3 HL60/ADM细胞内液-ADM标准曲线Fig 3 The calibration curve of adriamycin in HL60/ADM intracellular fluid

2.5.3 精密度与回收率试验 制备浓度为160、40、5 μg·mL－1的ADM标准品溶液各5份，按“2.4.2”项下“取培养上清液”开始操作，同日内测定5次，连续测定5 d，进样10 μL进行分析，考察方法的精密度与回收率。结果，平均回收率在98.20%～97.25%范围内，RSD≤1.73%；日内、日间RSD均≤2.81%。

2.6 样品采集

收集HL60/ADM细胞和处理组细胞，调整细胞密度为106个/mL，接种10 mL细胞悬液至100 mL培养瓶内，2种细胞分别接种3瓶，加入ADM使最终浓度为200 μg·mL－1。于加药后1、3、6 h分别收集分离的细胞和上清液，细胞用生理盐水清洗3次，计数，然后根据每瓶不同的活细胞数量，加入适量的生理盐水，调整细胞浓度为107个/mL。按反复冻溶法裂解细胞，即将细胞在－20℃以下冻存，室温溶解，反复3次，直至细胞冻溶液中无完整细胞，离心，取上清液作为细胞内液。取培养上清液或细胞内液0.5 mL，参照“2.4.2”项下“取培养上清液”开始操作，进样测定其ADM浓度。

2.7 统计学方法

试验数据采用±s表示，采用Origin 7.5软件（OriginLab data analysis and graphing software）进行统计学分析，组间差异比较采用t检验。P＜0.05表示有统计学差异。

3 结果

3.1 蟾酥注射液对HL60/ADM细胞生长的影响

HL60/ADM细胞经5个浓度梯度的蟾酥注射液处理后，细胞生长均受到不同程度抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。选取HL60/ADM细胞存活率在0.9以上的最大浓度作为蟾酥注射液的逆转剂量，即0.03 μg·mL－1。不同浓度蟾酥注射液对HL60/ADM细胞fu的影响见表1。

表1 不同浓度蟾酥注射液对HL60/ADM细胞fu的影响（±s，n＝3）Tab 1 Effects of different concentations of Chansu injection on fu of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

表1 不同浓度蟾酥注射液对HL60/ADM细胞fu的影响（±s，n＝3）Tab 1 Effects of different concentations of Chansu injection on fu of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

指标fu药物浓度/μg·mL－1 0.015 0.976±0.011 0.03 0.916±0.003 0.06 0.781±0.011 0.12 0.618±0.006 0.15 0.418±0.008

3.2 蟾酥注射液逆转作用测定

对照组和处理组的fa均随着ADM浓度增大而增加。根据Logit法计算出对照组IC50为19.83 μg·mL－1，处理组的IC50为9.86 μg·L－1，对照组IC50为处理组IC50的1.960 9倍。不同浓度ADM对HL60/ADM细胞fa的影响见表2。

表2 不同浓度ADM对HL60/ADM细胞fa的影响（±s，n＝3）Tab 2 Effects of adriamycin with different concentrations on fa of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

表2 不同浓度ADM对HL60/ADM细胞fa的影响（±s，n＝3）Tab 2 Effects of adriamycin with different concentrations on fa of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

与对照组比较：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

组别对照组处理组药物浓度/μg·mL－1 39.90 69.75±0.97 90.17±1.05＊2.49 6.31±1.04 6.45±1.12 4.99 12.25±0.88 33.40±5.76＊9.96 35.16±1.01 54.62±0.39＊18.95 49.66±8.54 70.27±2.67＊

图4 样品培养液、细胞中ADM含量测定结果A.样品培养液；B.细胞内液与对照组比较：＊P＜0.01Fig 4 Content determination of sample medium and intracelluar adriamycinA.sample culture medium；B.intracelluar fluid vs.control group：＊P＜0.01

3.3 HPLC法测定细胞内、外ADM的浓度

分别取对照组和处理组在不同时间点（1、3、6 h）的样品溶液各0.2 mL，每组3份，按“2.4.2”项下“取培养上清液”开始操作，进样50 μL做HPLC分析，比较各组细胞内、外ADM的含量。随着时间的延长，处理组中进入HL60/ADM细胞内的ADM逐渐增加，而HL60/ADM培养液中ADM药物浓度逐渐减少，表明蟾酥注射液能够增强耐药细胞摄取ADM的能力，与对照组细胞内ADM浓度比较有显著性差异（P＜0.01）。样品培养液、细胞中ADM含量测定结果见图4。

4 讨论

化疗是白血病治疗的主要手段，即使是各种异基因和自体造血干细胞移植，其疗效前提仍要求肿瘤细胞对放疗、化疗敏感，而MDR的产生却严重影响了白血病化疗的疗效，是造成白血病复发和难治的主要原因。MDR产生的原因十分复杂，是多因素共同作用的结果，目前研究得较多的是生化耐药和凋亡耐药。生化耐药指肿瘤细胞的遗传性及生化特性发生变化，致使细胞通过不同途径对药物产生耐药性，以肿瘤细胞内药物浓度降低为特征；凋亡耐药是指肿瘤细胞抗凋亡能力增强，对药物的敏感性降低。寻求一种有效的MDR逆转药物对提高白血病化疗效果十分关键。

本研究通过细胞毒性试验发现，蟾酥注射液能明显抑制HL60/ADM细胞的生长，且存在剂量依赖性，随着蟾酥注射液浓度的升高，HL60/ADM细胞fu逐渐减少，这说明蟾酥注射液是一种有效的肿瘤抑制药物。笔者选取fu＞0.9的最大浓度即非细胞毒性剂量浓度（0.03 μg·mL－1）作为诱导细胞的逆转剂量。进行体外试验发现，与对照组比较，ADM对HL60/ADM细胞增殖的抑制作用明显增强（P＜0.05），蟾酥注射液能部分逆转HL60/ADM细胞对ADM的耐药性，其逆转倍数为1.960 9倍。这些研究结果初步表明，蟾酥注射液可能既是一种有效的抗肿瘤药物，又是一种耐药逆转药物。因此，当与化疗药物联合进行白血病化疗时，一方面可以通过自身的抗肿瘤作用抑制白血病细胞的生长；另一方面还可以通过逆转白血病细胞的耐药性，提高其对化疗药物的敏感性，从而减小化疗药物的剂量，降低对机体的毒副作用。

MDR的逆转机制是十分复杂的，其中一个主要途径可能是通过下调细胞膜糖蛋白P170的表达，使其将化疗药物泵出细胞外的功能受到抑制，从而使化疗药物在白血病细胞内达到有效浓度，从而抑制白血病细胞的生长[8，9]。本研究采用HPLC法测定HL60/ADM细胞内、外的ADM浓度，结果显示在1、3、6 h经蟾酥注射液处理的HL60/ADM细胞内ADM含量，均较未经处理的细胞内ADM含量高，且随时间延长浓度增加更明显，而培养液中ADM含量则相反。提示蟾酥注射液可通过增加细胞内药物浓度来逆转HL60/ADM对ADM的耐药作用，机制可能与细胞药物转运泵有关，但具体的作用机制还有待进一步的研究。

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