复方脑康胶囊对β-淀粉样肽诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用研究

胡文军，邓朝晖，李国锋（1.南方医科大学南方医院药剂科，广州510515；.广州军区联勤部药品仪器检验所，广州 510500）

随着社会的老龄化，老年人的健康保健问题成为一个社会问题。根据流行病学资料，我国老年痴呆的患病率越来越高，1990年为4.61%，2001年为7.2%。随着年龄增长患病率逐浙增高，80岁以上的老年人患病率大于20%[1]。我国现有老年人口1.4亿，约有600万老年痴呆患者。老年性痴呆是中枢神经系统退行性疾病，以老年斑和神经纤维缠结为主要病理特征，而老年斑以β-淀粉样肽（β-peptide，Aβ）沉积为核心，可溶性Aβ对神经元具有毒性作用，在体外可导致神经元凋亡[2]。本研究拟通过观察复方脑康胶囊水提液对Aβ25-35诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞毒性的保护作用，探讨其药理作用，以期为临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

KSB-IA型超净工作台(天津尘埃净化设备厂)；MCO-15Ac型CO2培养箱（日本三洋公司)；CKX31型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；LD5-10B型离心机(北京医用离心机厂)；Σ960型酶标仪（台湾Metertech Inc公司）。

1.2 试药

复方脑康胶囊（广州军区联勤部药品仪器检验所，批号：091011），取胶囊内容物用蒸馏水煮沸40 min，将上清液调整为0.5 g（生药）/mL；作为复方脑康胶囊水提取液，备用；Aβ25-35、MTT、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（北京化工厂，批号：090825）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：090612）；青霉素、链霉素（上海奔大生物科技有限公司）。

1.3 细胞株

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株由南方医科大学南方医院提供。

2 方法[3，4]

2.1 SH-SY5Y细胞的培养

DMEM培养基加体积分数为0.15的胎牛血清、青霉素1×105u·L-1、庆大霉素8×104u·L-1，于5%CO2、37 ℃条件下培养SH-SY5Y细胞。待细胞增长至70%融合时，用含EDTA-2Na（0.1 g·L-1）的0.5 g·L-1胰蛋白酶消化传代，1∶4分瓶传代，每3～4 d传代1次。当细胞用药物（Aβ25-35、复方脑康胶囊）处理时，换用含体积分数为0.02的胎牛血清的培养基进行培养，每隔2 d换液1次。

2.2 药物试验浓度的确定

取复方脑康胶囊水提取液适量，加培养液使药物浓度分别为 0.062 5、0.125、0.25、0.5、0.725、1.0、2.0、4.0 g·L-1。将SH-SY5Y细胞以每1 mL含2.5×103个的密度接种于96孔板中，每孔体积200 μL，72 h后加上述不同浓度含药培养液，每组4孔。于接种后第4 天，每孔加MTT（5 g·L-1）20 μL ，37 ℃孵育4 h，吸出培养液，每孔加入DMSO 200 μL，振摇10 min，用酶标仪测定550 nm波长处吸光度（OD），细胞的存活率与其OD值呈正比。结果表明，最适浓度为0.725 g·L-1，因此选取0.725 g·L-1浓度用于以下试验。复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞存活率的影响见图1。

图1 复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig 1 Effect of Compound naokang capsules aqueous extract with different concentrations on metabolic rate of SHSY5Y cells

2.3 LDH漏出率测定

将SH-SY5Y细胞以1×104个的密度接种于24孔板，每孔体积1 mL，72 h后分为对照、Aβ25-35（25 μmol·L-1）和复方脑康胶囊（0.725 g·L－1）+Aβ25-35（25 μmol·L-1）组，每组8孔。于接种后第4天留取各组细胞培养液，按照LDH测定试剂盒所示方法，测定550 nm波长处的OD值，并以此值作为LDH漏出率。

2.4 MTT法测定细胞存活率

将SH-SY5Y细胞以每1 mL 2.5×103个的密度接种于96孔板，每孔体积200 μL，72 h后分为对照、Aβ25-35（25 μmol·L－1）和复方脑康胶囊（0.725 g·L－1）+Aβ25-35（25 μmol·L-1）组，每组8～12孔。于接种后第4天，每孔加MTT（5 g·L－1）20 μL，37 ℃孵育4 h ，吸出培养液，每孔加入DMSO 200 μL，振摇10 min，用酶标仪测定550 nm波长处OD值。

2.5 形态学观察

将SH-SY5Y细胞接种于35 cm2小皿中，72 h后分为对照、Aβ25-35（25 μmol·L－1）和复方脑康胶囊 0.725 g·L－1+Aβ25-3525 μmol·L－1组。加药后24 h ，瑞氏染色，每组随机取70 个细胞，用HPIAS21000高清晰度彩色图文报告管理系统及医学影像计算机处理系统测量细胞轴突长度和胞体面积。

2.6 统计学方法

全部数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，数据用±s表示，组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 LDH漏出率测定结果

细胞受损时LDH释放于培养上清液中，上清液LDH水平反映出细胞损伤或死亡程度，SH-SY5Y细胞损伤后培养液中的LDH明显增加。Aβ25-35组LDH漏出率显著高于对照组（P＜0.01），说明Aβ25-35可致SH-SY5Y细胞损伤；而复方脑康胶囊+Aβ25-35组显著低于Aβ25-35组（P＜0.01），说明复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞具有很好的保护作用。复方脑康胶囊对SHSY5Y细胞LDH漏出率的影响见表1。

表1 复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞LDH漏出率的影响（±s）Tab 1 Effect of Compound naokang capsules on LDH leakage rate of SH-SY5Y cells（±s）

表1 复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞LDH漏出率的影响（±s）Tab 1 Effect of Compound naokang capsules on LDH leakage rate of SH-SY5Y cells（±s）

与对照组比较：＊P＜0.01；与Aβ25-35组比较：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

组别对照组Aβ25-35组复方脑康胶囊+Aβ25-35组LDH漏出率/%789.1±63.5 1 344.2±253.3＊675.7±89.5#

3.2 细胞存活率测定结果

Aβ25-35组OD值显著低于对照组（P＜0.01），而复方脑康胶囊+Aβ25-35组的OD 值显著高于Aβ25-35组（P＜0.01），表明Aβ25-35可显著降低SH-SY5Y细胞的活性，而预先用复方脑康胶囊处理培养基，则可明显减轻Aβ25-35对细胞造成的损伤。复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞活性的影响见表2。

表2 复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞活性的影响（±s）Tab 2 Effect of Compound naokang capsules on cytoactive of SH-SY5Y cells assayed（±s）

表2 复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞活性的影响（±s）Tab 2 Effect of Compound naokang capsules on cytoactive of SH-SY5Y cells assayed（±s）

与对照组比较：＊P＜0.01；与Aβ25-35组比较：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

组别对照组Aβ25-35组复方脑康胶囊+Aβ25-35组OD值0.601±0.005 0.590±0.006＊0.622±0.004#

3.3 形态学观察结果

Aβ25-35组轴突长度和胞体面积显著小于对照组（P＜0.01），说明Aβ25-35可致SH-SY5Y细胞损伤；而复方脑康胶囊加Aβ25-35组轴突长度和胞体面积显著大于Aβ25-35组（P＜0.01），说明复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞具有较好的保护作用。复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞形态学的影响见表3。

表3 复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞的形态学影响（±s）Tab 3 Effect of Compound naokang capsules on morphology of SH-SY5Y cells（±s）

表3 复方脑康胶囊对SH-SY5Y细胞的形态学影响（±s）Tab 3 Effect of Compound naokang capsules on morphology of SH-SY5Y cells（±s）

与对照组比较：＊P＜0.01；与Aβ25-35组比较：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

组别对照组Aβ25-35组复方脑康胶囊+Aβ25-35组轴突长度/mm 46.14±9.18 25.28±7.67＊55.31±7.33#胞体面积/μm2 642.42±91.27 487.02±72.41＊709.22±66.45#

4 讨论

SH-SY5Y具有神经元的形态特点，能在体外不断传代，较原代培养的海马神经元容易培养，因而被广泛用于神经学领域的研究。SH-SY5Y细胞利于Aβ在细胞外的培养基中聚合并形成纤维性结构，同时将Aβ摄取入细胞内造成细胞内Aβ堆积在目前常用的细胞系中，并将Aβ摄取入细胞内进一步处理。Aβ与SH-SY5Y细胞间的这种关系为其作为体外介质研究Aβ的神经细胞毒性提供了可能。已有的研究发现，包括Aβ25-35在内的Aβ肽段均可诱导SH-SY5Y细胞出现与大鼠脑神经细胞变性相似的改变。因此，用β淀粉样蛋白作用于SH-SY5Y细胞制备的老年痴呆模型，是研究老年痴呆较好的细胞模型之一。

本研究结果表明，复方脑康胶囊在体外能促进细胞胞体和轴突的生长，能促进神经元存活信号转导，降低Aβ25-35诱导的SH-SY5Y神经元毒性。复方脑康胶囊的神经营养作用和神经保护作用可能与促进线粒体代谢和减少细胞损伤有关。

[1]中华医学会精神病学分会.中国老年期痴呆防治指南[M].北京：人民卫生出版社，2007：15.

[2]蔡 贞，姬志娟，徐艳玲，等.APP17肽对Aβ25-35诱导神经细胞凋亡的保护作用[J].中国药理学通报，2002，18（1）：31.

[3]张景艳，孟 艳，赵志炜，等.救脑益智胶囊对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y生长的影响[J].中国中西医结合杂志，2002，22（6）：82.

[4]余惠旻，周红祖.基于细胞凋亡表达的中药四性模式识别系统研究——西洋参和红参抗MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的药性学对比研究[J].中国药房，2009，20（18）：1 367.