超高效液相色谱法测定人参中人参皂苷Re 的含量

孙全乐，蔡广知，贡济宇#（1.长春医学高等专科学校，长春130031；.长春中医药大学，长春130117）

美国Waters公司在2004年推出了一种新的液相色谱技术——超高效液相色谱（UPLC）[1]，它采用1.7 μm粒径的色谱柱填料，能获得更高的柱效，并且在更宽的线速度范围内使柱效保持恒定，因而有利于提高流动相流速、缩短分析时间、提高分析通量。通过性能优越的色谱柱，精确梯度控制的超高压液相色谱泵，低扩散、低交叉污染的自动进样系统及高速检测器，使UPLC的峰容量、分析效率、灵敏度较常规高效液相色谱（HPLC）[2～4]有了很大的提高，为复杂体系的分离分析提供了良好的平台。

人参皂苷是人参中的主要活性成分，已确定结构的人参皂苷至少在30种以上[5，6]。近年来，人们围绕着人参皂苷的提取、分离、结构鉴定、含量测定、药理等方面展开了深入细致的研究，而人参皂苷的含量测定方法是重点研究课题之一。目前常用的HPLC法虽可达到分离效果，但此法耗时过长、溶剂用量大、成本高。因此，笔者采用UPLC法对人参中人参皂苷Re的含量进行测定，并与HPLC法进行比较，旨在确定更高效、快速和准确的测定方法，为后续研究打下基础。

1 仪器与试药

UPLC仪，含ACQUITY UPLC紫外检测器、Empower工作站（美国Waters公司）；KQ-2200E型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司，功率：100 W，频率：50 kHz）。

人参药材购于长春市各药房（吉林大药房、吉深大药房、永新大药房、吉林宏检公司、普天大药房、仁德大药房），经长春中医药大学张雅芝教授鉴定均为真品；人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110810-200609）；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters patened hybrid particle细内径柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-水（19∶81）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm。

2.2 对照品溶液的制备[7]

精密称取人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成浓度为0.2 mg·mL-1的溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取人参粗粉5 g，加8倍量水浸泡12 h，放入超声波提取器中，30℃下超声提取20 min，共提取3次，合并提取液，抽滤，水液用水饱和正丁醇萃取5次（20、20、20、15、15 mL），合并正丁醇液，用1%NaOH洗涤2次，每次20 mL，弃去碱液，再用正丁醇饱和水洗涤3次（20、20、15 mL），弃去水液，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 含量测定方法

采用外标法测定。分别吸取对照品溶液和供试品溶液5 μL注入UPLC仪，记录保留时间和峰面积积分值。

2.5 方法学考察

2.5.1 检测波长的选择 取人参皂苷Re对照品溶液在190～240 nm波长范围内作光谱扫描，结果发现人参皂苷Re在203 nm波长处有最大吸收，故选择203 nm作为检测波长。

2.5.2 流动相的选择 考察以不同体积比的乙腈-水（40∶60、30∶70、20∶80、19∶81）体系作为流动相的试验结果，发现当乙腈-水的体积比为19∶81时，人参皂苷色谱峰峰形稳定、无脱尾、分离完全，故最终确定以乙腈-水（19∶81）作为试验用流动相。

2.5.3 专属性考察 取人参皂苷Re对照品溶液、阴性对照溶液（甲醇）和供试品溶液按上述色谱条件分别进样分析，结果显示阴性对照溶液在人参皂苷Re峰保留时间处无干扰峰，人参皂苷Re峰达到有效分离，理论板数按人参皂苷Re峰计算应为6 000，表明本方法专属性良好。

2.5.4 线性关系考察 取人参皂苷Re对照品20.04 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 μL，按上述色谱条件进样测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝9 029X－16 060.2（r＝0.999 8，n＝5）。结果表明，人参皂苷Re的质量浓度在0.531～1.239µg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5.5 精密度试验 精密吸取人参皂苷Re对照品溶液5 μL，在上述色谱条件下重复进样6次，记录色谱图及峰面积积分值。结果，RSD＝1.14%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于配制后0、0.5、1、2、3、5 h注入UPLC仪测定，记录色谱图及峰面积积分值。结果，RSD＝1.03%（n＝6），表明室温下供试品溶液在5 h内稳定。

2.5.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品适量，精密加入一定量的人参皂苷Re对照品（1∶1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，照上述方法测定样品含量，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.5.8 重复性试验 取同一批样品适量，共6份，精密称定，分别按“2.3”项下方法制得供试品溶液，精密吸取5 μL注入UPLC仪。结果，人参皂苷Re含量的RSD＝0.08%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.6 样品含量测定结果

取在不同药店购买的人参药材样品适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，吸取5 μL注入UPLC仪，记录色谱图并计算人参皂苷Re的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2Results of content determination of the sample（n＝3）

3 讨论

3.1 UPLC法与HPLC法的比较

与HPLC法比较，UPLC法有几个优点：超高分离度、超高速度、超高灵敏度，具体如下：

3.1.1 缩短分析时间 中药材的成分十分复杂，需要高效和快速的分离分析方法测定其复杂组成。常规HPLC法测定人参皂苷Re的含量一般需要1 h左右的时间，样品组分才能得到较好的分离（见图1）；而采用UPLC法只需一半甚至更短的时间就能得到更好的分离效果和分析结果，测定人参皂苷只需在10 min内就可完成试验（见图2），如采用梯度洗脱的方式，还可进一步缩短分析时间[8]。

图1 高效液相色谱图（引用文献[8]）A.人参皂苷Re对照品；B.供试品；C.阴性对照Fig 1 HPLC chromatograms（referred literatures[8]）A.ginsenoside Re control；B.test sample；C.negative control

图2 超高效液相色谱图A.人参皂苷Re对照品；B.供试品；C.阴性对照Fig 2 UPLC chromatogramsA.ginsenoside Re control；B.test sample；C.negative control

3.1.2 增加峰容量，提高灵敏度 梯度条件下UPLC的峰容量变化已有报道[8～10]，该报道以小分子药物为研究对象，认为流动相比例、梯度洗脱时间、流速、色谱柱长度对峰容量影响最大，短柱、快速梯度变化可获得很高的峰容量；或增加分析时间，即使使用长柱也会获得更高的峰容量。UPLC使用1.7 μm粒径的色谱柱填料，使色谱柱的柱效极大提高、色谱峰变窄、峰容量增加。如图1和图2中，UPLC图中前5 min内共有5个色谱峰达到完全分离，而HPLC图中前40 min内共有6个色谱峰分离完全。此外，UPLC进样量为5 μL时，最高峰的吸收值为0.20 AU；HPLC进样量为5 μL时，与UPLC中最高峰的对应吸收值为1.70 AU，经过换算可得UPLC的灵敏度是HPLC的7倍左右。UPLC的高灵敏度优势对微量组分的研究具有重要意义。

3.2 方法转换

在保证相同分离度的条件下，UPLC与HPLC可以进行简单的方法转换，使HPLC上50 min完成的分析在UPLC上不到8 min即可完成。在相同分离机制条件下，主要转换流速、进样量及流动相梯度条件：根据转换软件，HPLC上10 μL的进样量在UPLC上为5 μL，HPLC上1 mL·min-1的流速转换到UPLC上为0.21 mL·min-1，从而使在HPLC上50 min完成的分析在UPLC上用21.78 min即可完成；在仪器压力允许及保证分离度的前提下，UPLC可适当增大流速，最大可达0.6 mL·min-1，在此条件下，7.62 min即可完成分析。本试验应用此转换方法，原HPLC转换为UPLC的条件为进样量5 μL、流速0.21 mL·min-1，可在10 min内完成分析；当增大流速为0.4 mL·min-1时，测试时间可缩短至5 min。

3.3 小结

本试验采用UPLC法测定人参中人参皂苷Re的含量，供试品溶液在10 min内分离完全，检测时间比HPLC法缩短了30 min，可见UPLC能够更快、更好地完成以往HPLC的工作。UPLC不但可以节省时间、提高效率、减少溶剂的消耗，还能为质谱提供最佳的色谱条件，为中药的分析建立良好的平台，为信息库的建立奠定良好的基础。有理由相信，UPLC法的超高分析速度、超高灵敏度，必将会在复杂中药体系的分离测试领域开创崭新局面。

[1]金高娃，章飞芳，薛兴亚.超高效液相色谱在复杂体系中药分离分析中的应用[J].世界科学技术中医药现代化，2006，8（3）：110.

[2]刘 军，王燕恒，付承光.高效液相色谱法分析人参皂苷[J].药物分析杂志，1998，18（2）：132.

[3]Zhai WM，Yuan YS，Zhou YX，et al.HPLC fingerp-rints identification ofPanax ginsengC.A.Mey.P.quinque folinL.andP.notoginseng（Burk.F.H.Chen）[J].Chin J Chin Mater Mater Med，2001，26（7）：481.

[4]高 敏.人参注射剂质量标准研究[J].云南中医中药杂志，2003，24（5）：31.

[5]张均田，刘 云，屈志炜，等.人参皂苷Rb1和Rg1对小鼠中枢神经递质受体和脑内蛋白质合成的影响[J].药学学报，1988，23（1）：12.

[6]王本祥.人参研究进展[M].天津：天津科学技术出版社，1991：22-54.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：8.

[8]张雪光，俄丽丹，孙 巍，等.高效液相色谱法测定人参片中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量[J].中国药业，2003，12（10）：42.

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[10]徐莲英，陶建生，冯 怡，等.中药制剂发展的回顾[J].中成药，2000，22（1）：6.