清肺合剂HPLC 指纹图谱研究Δ

曹莹莹，林能明，方 罗（浙江省肿瘤医院，杭州 310022）

清肺合剂是我院依据经验方开发的医院制剂，由白花蛇舌草、浙贝母、夏枯草等10味中药组成，功效清热化痰解毒、软坚散结消肿，具有抗肿瘤作用[1～3]，并可减轻放射性肺损伤，防治早期肺纤维化。目前，该药用于治疗肺癌及肺癌、放射性肺炎引起的咳嗽多痰、胸痛、咳血等症，疗效肯定[4，5]。由于历史原因，清肺合剂尚无完整的质量评价体系。中药指纹图谱是一种用综合、宏观、非线性的分析观念和质控模式来全面表征中药组成特征及质量的分析技术，已成为国际认同、提倡并推荐的中药质量评价手段[6，7]，在中药各研究领域的应用日益广泛[8，9]。因此，笔者应用二极管阵列（DAD）检测器建立样品的等吸收图，优化并建立清肺合剂的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，以期全面、整体地反映制剂质量，保证制剂工艺和质量的稳定性，确保患者用药安全。

1 仪器与试药

1100 HPLC仪，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外DAD检测器、数据处理工作站（美国Agilent公司）；BS 224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Multifuge 3R+高速离心机（德国Thermo Scientific（Heraeus）公司）；SY2200超声波清洗仪（上海超声仪器设备有限公司，频率：59 kHz，功率：90 W）。

绿原酸、咖啡酸、野黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为 110753-200413、110885-200102、110842-200504，均为供含量测定用）；对香豆酸、迷迭香酸标准品（成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为A0143、A0004，纯度均≥98%）；清肺合剂（浙江省肿瘤医院制剂室，批准文号：浙药 制 Z20050031，批 号 ：090602、090609、090630、090714、090728、090804、090825、090901、090915、091013、091020、091103、091117、091124、091201、091208）；乙腈、甲醇（色谱纯，浙江临海市浙东特种试剂厂）；水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

为保证制剂质量的稳定性和指纹图谱的有效性，清肺合剂所用药材的产地相对固定，产地如下：浙贝母（浙江）、白茅根（浙江）、重楼（云南、四川）、半枝莲（浙江、江苏）、夏枯草（贵州）、防己（浙江）、仙鹤草（浙江）、白花蛇舌草（浙江）、龙葵（浙江）、天龙（浙江）。

2 方法与结果

2.1 对照品贮备液的制备

精密称取绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、迷迭香酸对照品分别为0.002 3、0.000 5、0.001 9、0.003 3 g，分别置于10 mL量瓶中；精密称取野黄芩苷对照品0.010 2 g，置于100 mL量瓶中，分别用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.230、0.050、0.190、0.102、0.330 g·L-1的绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷和迷迭香酸对照品贮备液。4℃冰箱贮藏，备用。

2.2 供试品溶液的制备

精密量取清肺合剂2 mL，置于10 mL量瓶中，以水稀释至刻度，精密称重，超声30 min，冷却后补足失重，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱：Elit SinoChrom ODS-AP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.01%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0→60 min，A的体积百分比为95%→66%）；检测波长：330 nm；柱温：50 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：50 μL。该色谱条件下样品与对照品的指纹图谱分别见图1、图2。

图1 各批清肺合剂的HPLC指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprints of each batch of Qingfei mixture

图2 对照品的HPLC指纹图谱6.绿原酸；7.咖啡酸；9.对香豆酸；10.野黄芩苷；14.迷迭香酸Fig 2 HPLC fingerprint of substance control6.chlorogenic acid；7.caffeic acid；9.p-coumaric acid；10.scutellarin；14.rosmarinic acid

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一份清肺合剂供试品溶液适量，连续进样6次，按“2.3”项下色谱条件进行测定。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3.0%，表明本方法精密度良好，符合指纹图谱测定要求。

2.4.2 稳定性试验 取同一份清肺合剂供试品溶液适量，按“2.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、16、24 h进样测定。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取同一批清肺合剂适量，共6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3”项下色谱条件测定。结果，各主要共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3.0%，表明本方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

取16批清肺合剂适量，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.3”项下色谱条件进样检测得到指纹图谱；并利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件生成清肺合剂对照指纹图谱（见图2），其中共有色谱峰16个，其峰面积占总峰面积的80.9%以上。经对照品保留时间和紫外吸收曲线对比确认，6号峰为绿原酸，7号峰为咖啡酸，9号峰为对香豆酸，10号峰为野黄芩苷，14号峰为迷迭香酸。其中对香豆酸色谱峰保留时间（约为（24.567±0.049）min）和峰响应值适中、分离度理想，确定为参照峰（S峰）。以9号色谱峰为参照，计算共有特征峰的相对峰面积和相对保留时间，可得各峰保留时间稳定，RSD在0.050%～0.508%之间。16批清肺合剂HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积与相对保留时间见表1。

2.6 相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件对所有样品的指纹图谱进行数据处理，并计算16批清肺合剂指纹图谱间及其与对照指纹图谱之间的相似度。结果，除批号为090915的样品与对照指纹图谱的相似度略低于0.9（0.894）以外，其余相似度均在0.936以上，表明各批样品间的差异性较小。

表1 16批清肺合剂HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积与相对保留时间Tab 1 Relative peak area and relative retention time of the common peaks of HPLC fingerprints of 16 batches of Qingfei mixture

3 讨论

为了得到满意的分离效果，笔者比较了不同填料色谱柱（SinoChrom ODS-AP、SinoChrom ODS-BP、Lichrospher C18、Zorbax Elipse XDB-C18）的试验效果，结果以SinoChrom ODS-AP柱的分离效果最佳。由于合剂中的成分众多，各化合物紫外吸收行为差异较大，故笔者同时采用DAD检测器建立样品的光谱-色谱3D吸收图和等吸收图，直观、便捷、快速、准确地选择适宜的检测波长，考察190～400 nm区间不同波长下的图谱，结果在330 nm波长下，色谱基线平稳，噪声干扰较小，各洗脱区段出峰均匀，色谱峰吸收丰度适中，图谱信息完整。流动相的pH值和温度对分离效果的影响较大，故笔者分别以甲醇/乙腈和乙酸-乙酸铵缓冲系、磷酸-磷酸盐缓冲系、三氟乙酸缓冲液的不同配比、不同浓度的流动相系统进行梯度洗脱试验，比较不同洗脱条件下的色谱图，选择分离效果好、峰数多、峰形佳、时间尽可能短的最佳色谱条件，最终确定以0.01%磷酸溶液和乙腈进行梯度洗脱，能有效改善峰形，提高分离度，使基线漂移小。此外，选择较高的柱温也有利于分离。

通过相似度计算发现，16批样品的相似度较高，均具有相同的色谱特征峰，分离分析效率高，且各色谱特征峰保留时间稳定；相似度计算结果提示，清肺合剂的批间稳定性较高，各批制剂的质量具有一致性，表明本试验所建立的指纹图谱具有稳定性和可控性。

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