玄参饮片-破壁粉体-破壁粉粒的HPLC 指纹图谱研究Δ

2012-08-06焦豪妍杨燕军徐吉银张华秀广东食品药品职业学院中药研究所广州51050广东中山市中智药业集团有限公司广东中山58437

中国药房 2012年3期

焦豪妍，杨燕军，徐吉银，张华秀（1.广东食品药品职业学院中药研究所，广州51050；.广东中山市中智药业集团有限公司，广东中山 58437）

玄参（Scrophulariae Radix）为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，主要分布于安徽、江苏、浙江、福建、江西、湖南、湖北和贵州等地。临床上用于治疗热病伤阴、舌绛烦渴、温毒发斑、津伤便秘、骨蒸劳嗽、目赤、咽痛、瘰疬、白喉和痈肿疮毒证[1]。玄参中已分离出化学成分50多种，主要含有环烯醚萜、苯丙素苷、有机酸及挥发油等[2]。

中药破壁粉粒是在中医“治未病”的治疗思想和辨证论治的理论体系指导下，结合现代先进的超微粉碎技术开发出的一种新型中药饮片。它是将特定的单味中药饮片进行细胞级粉碎，在粉碎过程中，中药不同组织、不同部位经过粉碎和混炼后，各种物质组分充分暴露和匀化，形成均匀包含各种相同比例物质组分的破壁粉体，再采用成型技术将中药破壁粉体加工成40～80目的颗粒。它具有安全性高、均匀度高、生物利用度高、药材利用率高、应用方式便捷灵活等优点。

色谱指纹图谱分析技术作为鉴别中药材及其制剂整体质量的有效手段得到越来越广泛的应用[3，4]。文献报道玄参的指纹图谱研究多采用高效液相色谱（HPLC）法[5，6]。因此，本试验采用HPLC法首次建立了玄参饮片-破壁粉体-破壁粉粒三者的指纹图谱并进行比较，旨在从整体和宏观上控制玄参破壁粉粒的质量。

1 仪器与试药

2695 HPLC仪、2996DAD检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；HS10260D超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司，频率：40 kHz，功率：500 W）。

哈巴俄苷、肉桂酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为111730-200604、110786-200503）；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯；玄参药材购自浙江省盘安县大盘镇，采摘期为农历10月、11月，经广东食品药品职业学院刘晓春副教授鉴定为玄参科植物玄参的干燥根；玄参破壁粉体和破壁粉粒样品由中山市中智药业集团有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：GL Sciences Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-1%冰醋酸水（B），梯度洗脱（0～45 min，10%～70%A；45～55 min，70%～90%A；55～65 min，90%～90%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 玄参饮片、破壁粉体及破壁粉粒供试品溶液的制备

取玄参饮片、破壁粉体和破壁粉粒样品各10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇35 mL，密塞，称定重量，浸泡18 h，超声提取1 h，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备（1）取哈巴俄苷对照品适量，精密称定，用30%甲醇溶解制成浓度为550 μg·mL-1的溶液，即得哈巴俄苷对照品溶液。（2）取肉桂酸对照品适量，精密称定，用30%甲醇溶解制成浓度为710 μg·mL-1的溶液，即得肉桂酸对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 空白试验吸取空白溶剂（95%乙醇）10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，空白无干扰。

2.3.2 精密度试验取同一批供试品（玄参饮片1号）溶液适量，连续进样5次，记录指纹图谱。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度均＞0.950，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积的RSD均＜5.00%，表明该方法精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

2.3.3 稳定性试验取同一批供试品（玄参饮片1号）溶液适量，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h检测指纹图谱。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度均＞0.950，各主要色谱峰相对保留时间的RSD均＜5.00%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.3.4 重复性试验取同一批次样品（玄参饮片1号）适量，按“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，记录指纹图谱。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度均＞0.950，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积的RSD均＜5.00%，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立及各项技术参数的测定

2.4.1 标准指纹图谱和共有指纹峰标定按“2.1”项下色谱条件测定10批玄参饮片、10批破壁粉体和10批破壁粉粒的指纹图谱，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件对指纹图谱数据进行评价，详见图1～图3；制定优化的10批玄参饮片、10批破壁粉体和10批破壁粉粒的标准指纹图谱（共有模式），详见图4～图6。可确定玄参饮片、破壁粉体和破壁粉粒的共有峰均为14个，经对照品鉴定其中玄参饮片10号峰、破壁粉体与破壁粉粒11号峰为肉桂酸，玄参饮片12号峰、破壁粉体与破壁粉粒13号峰为哈巴俄苷，玄参饮片和破壁粉粒中肉桂酸的色谱峰响应更高，因此确定肉桂酸的峰为参照峰。

图1 10批玄参饮片的HPLC指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprints of 10 batches of S.ningpoensis decoction pieces

图2 10批玄参破壁粉体的HPLC指纹图谱Fig 2 HPLC fingerprints of 10 batches of S.ningpoensis cellwall broken powder

2.4.2 共有峰的相对保留时间和相对峰面积玄参饮片以10号峰的保留时间和峰面积为1，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各批次玄参饮片中共有峰的相对保留时间非常接近，RSD在0.00%～1.30%之间，这也进一步证实了共有峰选择的准确性。而各批样品之间共有指纹峰的相对峰面积存在一定的差异，证明不同批次的药材样品在含量上存在一定的差异。

玄参破壁粉体和破壁粉粒以11号峰的保留时间和峰面积为1，计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各批次破壁粉体和破壁粉粒中共有峰的相对保留时间非常接近，RSD分别在0.00%～0.51%和0.00%～0.82%之间，同样也进一步证实了共有峰选择的准确性；各批样品之间共有

指纹峰的相对峰面积存在一定的差异，同样证明不同批次的破壁粉体和破壁粉粒样品在含量上存在一定的差异。

2.4.3 相似度计算采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件分别对10批玄参饮片、10批破壁粉体和10批破壁粉粒的指纹图谱进行相似度分析，分别与各自的标准指纹图谱（共有模式）比较，可得10批玄参饮片的相似度为0.969、0.948、0.943、0.991、0.999、0.991、0.980、0.992、0.993 和0.997；10批破壁粉体的相似度为0.986、0.906、0.976、0.993、0.992、0.996、0.991、0.984、0.992和0.996；10批破壁粉粒的相似度为0.986、0.938、0.978、0.995、0.995、0.999、0.979、0.989、0.989和0.995。玄参饮片、破壁粉体和破壁粉粒的相似度均＞0.900，表明所建立的指纹图谱技术指标稳定、重复性较好。

2.4.4 玄参饮片-破壁粉体-破壁粉粒相关性的研究破壁粉粒作为一种新型的饮片，破壁粉体相当于中间产品。笔者对饮片-破壁粉体-破壁粉粒三者的相关性进行了研究，比较图4～图6可以看出，三者生成的共有模式非常相似，标注的共有峰也基本相似，从饮片到破壁粉体再到破壁粉粒各主要成分相关性良好、归属性强，能全面评价破壁粉粒的质量。