p53异构体Δ133p53在不同胃组织中的表达及意义

李芳芳，张红梅，张小茜，张广学，曲梅花，季万胜

(1潍坊医学院附属医院，山东潍坊261041;2潍坊医学院药学与生命科学学院应用药理学实验室)

胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，全世界死于胃癌的人数每年超过65万［1］。胃癌的发生发展是一个复杂的过程，涉及到多种癌基因激活、抑癌基因的失活以及由此引起的细胞生物学行为改变等许多方面，但其确切的发病学机制尚未完全阐明。p53是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。在过去25年中，肿瘤抑制蛋白p53被认为是TP53的惟一产物，但从2002年开始，许多研究发现，至少存在9种p53选择性剪接异构体，并证实它们具有调节p53功能的作用。不同的p53异构体作为一种转录因子能够调节p53的转录活性，引发一系列对p53活性产生重要作用的生物学反应，共同参与细胞周期及细胞凋亡等细胞生命过程的调节，对肿瘤的发生发展有重要作用。因此，研究不同p53异构体特有的生物学功能，对深入认识细胞凋亡调节及肿瘤发生的机理有重要作用。目前，有关p53剪接异构体在人类组织中表达情况的研究甚少，其表达范围和意义尚不清楚。本研究采用巢式逆转录多聚酶链反应(NT-PCR)检测p53选择性剪接异构体Δ133p53 mRNA在胃癌、慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎中的表达变化，初步探讨其表达规律。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集潍坊医学院附属医院2010年11月～2011年8月80例胃癌患者的手术切除及胃镜下活检组织标本，患者男56例、女24例，年龄23～81岁。其中胃癌(GC)30例、慢性萎缩性胃炎(CAG)30例、慢性浅表性胃炎(CSG)20例，胃癌的诊断符合2002年国际抗癌联盟制定的TNM分期标准;按组织学标准进行分类，其中高分化胃癌4例、中分化胃癌18例、低分化胃癌8例。患者无长期糖皮质激素及非甾体抗炎药服用史，术前均未接受任何放化疗。

1.2 方法

1.2.1 胃组织RNA提取 应用UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒提取胃组织的总RNA。详细步骤如下:剪取胃组织约0.05 g，加入1 ml Trizol，用匀浆器进行匀浆处理后转移至EP管中(置于冰上操作)。将匀浆液室温放置10 min，使核蛋白与核酸完全分离。加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡30 s，室温放置3 min。12 000 r/min，4℃离心10 min。吸取上层水相转移至干净的EP管中，加入1/2体积无水乙醇混匀。将UNIQ-10柱放入收集试管，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮液全部加至收集试管中，静置2 min，12 000 r/min，离心 3 min，倒掉收集试管中废液。将UNIQ-10柱放回收集试管中，加入 500 μL RPE Solution，静置 2 min，10 000 r/min，离心30 s，倒掉收集试管中废液。重复此步骤一次。将UNIQ-10柱放回收集试管中，10 000 r/min，离心2 min。将UNIQ-10柱放入干净的1.5 mL EP管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treated ddH2O，静置 5 min，12 000 r/min，离心 2 min，所得到的液体即为RNA，置于－150℃冰箱保存备用。

1.2.2 NT-PCR检测 Δ133p53 按照 MMLV第一链cDNA合成试剂盒说明书及相关文献操作，以试剂盒内的Oligo-p(dT)18 Primer为随机引物，以MMuLV RT酶为逆转录酶进行体外逆转录反应。在冰浴的干净EP管中加入如下反应混合物:总RNA 2 μL，Oligo-p(dT)18 Primer 1 μL，RNase-free water 9 μL，总体积12μL。轻轻混匀后离心5 s。反应混合物在PCR仪中于70℃水浴5 min，冰浴30 s，然后离心5 s。将EP管冰浴，再加入如下组分:5×Reaction Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL dNTP Mix(10 mmol/L)2 μL，总体积 7 μL，轻轻混匀后离心5 min。反应混合物在PCR仪中于70℃水浴5 min，加入1 μL M-MuLV RT(20 U/μL)，终体积为20μL。反应混合物在PCR仪中于70℃水浴60 min。混合物在PCR仪中于70℃加热10 min结束反应，合成的cDNA即作为PCR反应的模板，－20℃分装保存备用。测量Δ133p53的mRNA表达情况所需引物见表1［1］，PCR反应条件为:94℃变性1 min，58 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环。反应体系为:Sterilized ddH2O 24μL、10×PCR Buffer 5 μL、2 mmol/L dNTP 5 μL、上游引物(10 μmol/L)5 μL、下游引物(10 μmol/L)5 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、Taq DNA 多聚酶 1 μL、模板DNA 2μL，总体积50μL。最后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果放入BiospectrumAC凝胶成像系统扫描并拍照。

表1 Δ133p53的引物序列和目的基因长度

1.2.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件，数据以百分比表示，比较进行χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Δ133p53分别表达在 21例(70.0%)胃癌、15例(50.0%)慢性萎缩性胃炎、5 例(25.0%)慢性浅表性胃炎组织中，提示Δ133p53在胃癌、慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎组织中的表达呈逐渐明显下降趋势(P均＜0.05)。见图1。8例胃低分化癌中，7例表达Δ133p53;18例胃中分化癌中，14例表达Δ133p53;4例高分化癌中，1例表达Δ133p53。

3 讨论

图1 Δ133p53电泳结果

p53是最早确认的肿瘤抑制基因，超过半数的肿瘤组织表达突变p53蛋白，突变p53蛋白失去对细胞周期的控制，基因变异得以积累，被认为是肿瘤发生的重要机制。但最近的研究表明，中国内地胃癌p53突变率为30.6%［2］，可见胃癌的发生并没有伴随着p53的高突变率，说明胃癌的发生可能存在其他的机制导致了p53基因的失活或影响了其转录活性。

选择性剪接是指从一个mRNA前体通过选择不同的剪接位点组合产生不同的mRNA剪接变异体的过程，经常发生在隐蔽的剪接位点，致使外显子遗漏和(或)内含子保留。许多研究证实，选择性剪接与维持细胞正常生理功能、组织的发育调节以及人类疾病的发生有着密切联系［3，4］。人类p53基因位于17P13.1，全长19 200 bp，含有11个外显子和10个内含子。以往的研究认为p53基因结构简单，仅包含1个启动子和3种 mRNA剪接异构体［5］。随着研究的深入，认识到人类p53基因和其家族基因p63、p73一样含有2个选择性启动子［6］。到目前为止，人类p53基因至少编码9种剪接异构体，它们分别为 p53、p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β 和Δ133p53γ(通过位于内含子4上的启动子和对内含子9的选择性剪接)以及 Δ40p53、Δ40p53β和Δ40p53γ(通过对内含子2的选择性剪接或翻译过程中的选择性启动［6，7］)。

研究已发现，p53异构体在乳腺肿瘤、急性髓系白血病、头颈部肿瘤、黑色素瘤、卵巢肿瘤、肾细胞癌及结肠肿瘤中呈现差异表达的特征，特定异构体的表达与肾细胞癌、头颈部肿瘤和卵巢肿瘤的发生相关［8～11］;但p53异构体与胃癌之间关系的相关研究国内外尚无报道。

在本试验中，应用NT-PCR技术检测p53剪接异构体Δ133p53，结果显示随着胃癌恶性程度的升高，Δ133p53的表达呈上升趋势。由于样本例数较少，胃癌分化类型之间的比较显示无统计学意义。通过此现象我们推测，Δ133p53的表达在人慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃高分化癌、胃中分化癌、胃低分化癌组织中呈逐渐上升趋势，即随着胃癌恶性程度的升高，Δ133p53的表达呈上升趋势，进而推测Δ133p53可能为促癌因子，为今后这方面的科研探索提供了一个很有意义的思路和推测。

总之，p53剪接异构体Δ133p53与胃癌的发生有一定关系。目前有关p53剪接异构体与胃癌的研究才刚刚起步，其作用机制尚不清楚，还需大量的工作去做进一步探讨。这对深入认识胃癌发生的机理有重要意义，并为胃癌的早期诊断和治疗提供重要依据。

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