YB-1抑制三氧化二砷诱导的胃癌细胞自噬机制

龙璐璐，许文林，沈慧玲，冷加燕

(江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏镇江212002)

自噬是细胞的一种可调控的溶酶体降解过程，通过降解长寿命蛋白、部分细胞器等以实现自身代谢需要和细胞器的更新［1］。近年研究发现，肿瘤细胞的自噬和自噬性细胞死亡在一些治疗条件下可以被激活［2，3］，在肿瘤的发生发展及治疗中的作用越来越受到关注。Y-box结合蛋白-1(YB-1)是Y-box结合蛋白家族成员之一，参与基因的转录翻译、DNA修复、细胞增殖与再生、药物的耐药和细胞应激反应等多种生物过程。本实验室前期研究发现小剂量的As2O3可以诱导肿瘤细胞自噬，YB-1可以抑制As2O3诱导的自噬［4］。为进一步探讨YB-1抑制自噬的分子机制，2011年3月～2011年12月，本研究应用As2O3模拟细胞损伤模型，利用 RNA干扰(RNAi)技术部分沉默或过表达人胃癌BGC-823细胞中的YB-1基因，观察 As2O3在BGC-823细胞自噬中的作用，并初步阐明其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌BGC-823细胞由本实验室保存。As2O3购自哈尔滨伊达药业。HA14-1购自美国Calbiochem公司。单丹磺酰戊二胺(MDC)购自Sigma公司。胎牛血清购自杭州四季青，人DMEM培养基购自GIBCO公司。RNA提取试剂盒购自上海生工公司，反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒、蛋白提取试剂盒购自TaKaRa公司。HRP标记的羊抗兔、鼠二抗均购自北京康为世纪生物公司。兔抗人YB-1、Bcl-2、Beclin1、LC3 抗体，鼠抗人 P62、actin 抗体，均购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组 人胃癌BGC-823细胞以1×106接种在培养瓶中，用含有10% 胎牛血清DMEM培养基，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。按照实验设计分组:空白对照(control)组、空质粒(HK)组、干扰质粒(siYB-1)组、空病毒(AdGFP)组、pAd1Easy/YB1腺病毒表达载体(AdYB-1)组，使用LipofectamineTM2000脂质体转染后24 h，鉴定转染效率。

1.2.2 HA14-1的制备及分组 HA14-1是Bcl-2的小分子配体，可与Bcl-2蛋白结合而降低其生物学活性。将该化合物以104μmol/L的浓度溶解于DMSO中，－70℃避光保存。根据实验设计将BGC-823细胞分为三组:AdGFP组、AdYB-1组、HA14-1组(AdYB-1转染后加入50μmol/L的HA14-1作用4 h)。

1.2.3 qRT-PCR检测Bcl-2和Beclin1的基因表达

Trizol法提取各组BGC-823细胞的总RNA，逆转录为cDNA，美国BIO-RAD荧光定量PCR仪扩增分析。Bcl-2基因上游引物:5'-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3'，下 游 引 物:5'-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3'。Beclin1基因上游引物:5'-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3'，下游引物:5'-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3'。β-actin为内参，上游引物:5'-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3'，下游引物:5'-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3'。

1.2.4 MDC染色观察细胞自噬泡的聚集 BGC-823细胞以每孔5×104接种于24孔板中，按照实验分组。转染24 h后加入4μmol/L As2O3处理24 h，4%多聚甲醛固定，50μmol/L的MDC孵育。激光共聚焦显微镜下观察细胞自噬空泡的积聚。

1.2.5 Western blot检测 Beclin1、P62、LC3 蛋白表达 收集各组 BGC-823细胞，RIPA裂解细胞，12 000 r/min，4℃离心，SDS-PAGE分离蛋白，转移到PVDF膜上。1%BSA封闭 2 h。YB-1抗体(1∶200)、Bcl-2 抗 体 (1 ∶500)、Beclin1 抗 体(1∶800)、P62 抗体(1∶300)、LC3 抗体(1∶3 000)4℃孵育过夜。HRP标记羊抗兔二抗(1∶5 000)、羊抗鼠二抗(1∶5 000)孵育1 h。凝胶成像系统拍照分析。以β-actin为内参，以靶蛋白积分光密度(IOD)值与β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相对水平。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，数据均用x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异比较采用q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组YB-1的表达 与HK组和AdGFP组相比，siYB-1组YB-1蛋白表达明显降低，AdYB-1组YB-1蛋白表达明显升高。见图1。

图1 转染siYB-1和AdYB-1后YB-1的表达

2.2 各组 Bcl-2、Beclin1基因表达水平比较 与AdGFP组和HK组相比，AdYB-1组Bcl-2/β-actin基因相对表达量明显增加(P＜0.05)，siYB-1组Bcl-2/β-actin表达降低(P＜0.05)。见图2。各转染组Beclin1/β-actin基因相对表达量无统计学差异。

图2 qRT-PCR检测Bcl-2/β-actin基因相对表达量

2.3 各组 Bcl-2、Beclin1蛋白表达水平比较 与AdGFP组和HK组相比，Bcl-2蛋白表达在AdYB-1组升高，在siYB-1组降低;而 Beclin1蛋白表达在AdYB-1组明显降低，siYB-1组显著升高(P均 ＜0.01)。见图3A。自噬水平检测显示，AdYB-1组P62蛋白聚集增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低(P ＜0.01)，抑制了自噬;应用siYB-1干扰YB-1表达后，促进了自噬的发生。

2.4 HA14-1对YB-1抑制自噬的影响 MDC染色结果显示，与AdGFP组相比，AdYB-1组自噬泡聚集减少，而转染AdYB-1后加入HA14-1处理后，自噬泡重新聚集。Western blot检测结果显示，与AdGFP组相比，AdYB-1组Beclin1蛋白表达降低，P62蛋白聚集增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ减少，自噬水平降低。转染AdYB-1并加入HA14-1后，Beclin1蛋白恢复表达，P62蛋白降解增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ重新升高。见图3B。提示HA14-1可能通过抑制Bcl-2的活性、上调Beclin1的表达影响YB-1对As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的活性。

图3 Western blot检测蛋白结果

3 讨论

自噬广泛存在于真核细胞的病理生理过程中，在维持细胞稳态和促进细胞生存方面起重要作用［5］。近年研究发现As2O3可诱导多种肿瘤细胞发生自噬及自噬性细胞死亡。本实验室的前期研究也发现As2O3可诱导BGC-823细胞自噬的发生。

YB-1是肿瘤细胞生存的一个正调控因子。YB-1的表达可以促进肿瘤细胞增殖，介导肿瘤细胞抗凋亡及产生耐药等［6］。但是有关YB-1抑制自噬的研究并未见报道，本实验室的前期研究首次揭示YB-1可以抑制As2O3诱导的肿瘤细胞自噬。提示YB-1作为一个癌基因和抗细胞死亡的分子，在肿瘤的进程中可能参与更广泛的病理过程，其抑制As2O3诱导的自噬的功能可能为肿瘤发生发展及治疗提供新的理论依据。本实验采用RNAi技术部分沉默或过表达YB-1，探讨YB-1抑制As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的分子机制。

Beclin1是调节细胞自噬过程的关键基因之一，其机制主要是与Ⅲ型PI3K形成复合物，参与募集胞质中含有FYVE或PX基序的蛋白质，调节前自噬体的形成及自噬蛋白在自噬体膜上的定位过程［7］。Pattingre等［8］研究表明，抗凋亡蛋白 Bcl-2能够与Beclin1形成复合物，抑制Beclin1依赖的自噬。本研究发现Bcl-2与YB-1抑制As2O3诱导的BGC-823细胞自噬相关，并且加用Bcl-2抑制剂HA14-1使Bcl-2失活后，Beclin1表达下调，减弱了YB-1对自噬的抑制作用。提示YB-1对As2O3诱导的BGC-823细胞自噬的抑制作用可能是通过上调了Bcl-2的表达，从而抑制Beclin1而实现的。

［1］Paglin S，Hollister T，Delohery T，et al.A novel response of cancer cells to radiation involves autophagy and formation of acidic vesicles［J］.Cancer Res，2001，61(2):439-444.

［2］Kanzawa T，Germano IM，Komata T，et al.Role of autophagy in temozolomode-induced cytotoxicity for malignant glioma cells［J］.Cell Death Differ，2004，11(4):448-457.

［3］Edinger AL，Thompson CB.Death by design:apoptosis，necrosis and autophagy［J］.Curr Opin Cell Biol，2004，16(6):663-669.

［4］冷加燕，许文林，沈慧玲，等.YB-1腺病毒载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞耐药性的影响［J］.江苏大学学报(医学版)，2011，21(4):33-37.

［5］ Lockwood TD，Minassian IA.Protein turnover and proliferation.Failure of SV-3T3 cell to increase lysosomal proteinases，increase protein degradation and crease net protein accumulation［J］.Biochem J，1982，206(2):215-218.

［6］Uramoto H，Izumi H，Ise T，et al.p73 interacts with cMyc to regulate Y-box-binding proyein-1 expression［J］.J Biol Chem，2002，277(35):31694-31702.

［7］Meijer AJ，Codogno P.Regulation and role of autophagy in mammalian cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2445-2462.

［8］Pattingre S，Tasssa A，Qu X，et al.Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy［J］.Cell，2005，122(6):927-939.